Набор для обнаружения антигенов ротавируса с подтверждением положителльных результатов

Биологические и иммунологические свойства

Тест-система иммуноферментная для обнаружения антигенов ротавируса с подтверждением положителльных результатов позволяет подтверждать наличие антигенов ротавируса в исследуемых образцах. Исследуемые образцы разводят с шагом 10 и каждое разведение вносят в две лунки с сорбированными поликлональными антиротавирусными антителами. В одну из лунок добавляют иммунную сыворотку, специфические антитела которой блокируют связавшиеся антигены ротавируса. В другую парную лунку вносят нормальную сыворотку, не содержащую специфических антител. Затем во все лунки вносят пероксидазный конъюгат на основе моноклональных антител к группоспецифическому антигену ротавируса. Образующиеся комплексы антитело-антиген-конъюгат обнаруживаются по появлению окрашивания на этапе ферментативного превращения субстратного раствора.

Если исследуемый образец содержит ротавирусные антигены, тоинтенсивность окраски субстратного раствора в лунке с иммунной сывороткой будет ниже, чем в лунке с нормальной сывороткой.

Набор тест-системы иммуноферментной для обнаружения антигенов ротавируса с подтверждением положителльных результатов рассчитан на проведение от 1 до 48 анализов, включая контроли.

Назначение

Тест-система иммуноферментная для обнаружения антигенов ротавируса с подтверждением положителльных результатов предназначена для подтверждения наличия антигенов ротавируса в экстрактах фекалий больных острыми гастроэнтеритами в первые 5 суток от начала заболевания, контактных лиц и здоровых носителей, а также в воде и продуктах питания.

Тест-система иммуноферментная для обнаружения антигенов ротавируса с подтверждением положителльных результатов может быть использована для лабораторной диагностики заболеваний ротавирусной этиологии и осуществления эпидемиологического надзора за инфекцией.

Необходимые меры предосторожности

Компоненты тест-системы иммуноферментной для обнаружения антигенов ротавируса с подтверждением положителльных результатов не содержат инфекционного материала, однако анализируемые пробы могут быть потенциально инфицированы, что требует соблюдения определенных мер безопасности при работе с тест-системой:

  • работать в резиновых перчатках;
  • не пипетировать растворы ртом;
  • при попадании на кожу или слизистые оболочки раствора серной кислоты немедленно смыть его большим количеством проточной воды;
  • все отходы (проанализированные пробы, использованные наконечники и посуду) собрать в контейнер и затем обработать дезинфицирующим раствором (6 % раствором перекиси водорода или 70 % раствором спирта).

Состав набора

  • Восьмилуночные стрипы с иммобилизованными антиротавирусными иммуноглобулинами - 12 шт.
  • Положительный контроль, содержащий ротавирусные антигены, инактивированный прогреванием (К+), 0,6 мл (красный раствор) - 1 пр.
  • Отрицательный контроль, не содержащий ротавирусных антигенов, инактивированный прогреванием (К-), 0,6 мл ( зеленый раствор) - 1 пр.
  • Нормальная сыворотка, не содержащая антител к ротавирусным антигенам (НС), 0,6 мл, (зеленый раствор) - 1 пр.
  • Иммунная сыворотка, содержащая антитела к ротавирусным антигенам (ИС) 0,6 мл, (малиновый раствор) - 1 пр.
  • Концентрат конъюгата (х20), содержащий моноклональные антитела к ротавирусам , меченные пероксидазой хрена (Концентрат конъюгата), 0,6 мл (синий раствор) - 1 пр.
  • Концентрат (х25) фосфатно-солевого буферного раствора, содержащий детергент (ФСРТ), 20 мл (бесцветный раствор) - 2 фл.
  • Раствор для разведения концентрата конъюгата (РРК), 10 мл (бесцветный раствор) - 1 фл.
  • Цитратный буферный раствор с перекисью водорода (ЦБП), 10 мл (бесцветный раствор) - 1 фл.
  • Раствор для разведения исследуемых проб (РИП), 10 мл (голубой раствор) - 1 фл.
  • Раствор тетраметилбензидина (ТМБ), 2,5 мл (бесцветный или слабо голубой раствор) - 1 фл.
  • Раствор серной кислоты (Стоп-реагент), 5,0 мл (бесцветный раствор) - 1 пр.
  • Полиэтиленовый пакет с молнией - 1шт.
  • Инструкция по применению - 1 шт.

Подготовка реагентов

  • Все растворы и реагенты выдерживают перед началом работы при температуре (15 - 25) °С в течение 1 ч.
  • Иммуноферментный анализ рекомендуется проводить с использованием новых, не подвергавшихся обработке наконечников для пипеток. Растворы каждого компонента тест-системы иммуноферментной для обнаружения антигенов ротавируса с подтверждением положителльных результатов и каждого исследуемого образца необходимо брать с помощью индивидуального наконечника для пипеток.
  • В зависимости от числа исследуемых проб отбирают необходимое количество стрипов (полосок по 8 лунок в каждой). Остальные стрипы вынимают из рамки-держателя и хранят в закрытом полиэтиленовом пакете с молнией при температуре (2 - 8) °С.
  • При использовании автоматических промывных устройств необходимо не допускать образования микробных проростов. Для этого после окончания анализа шланги и емкости для раствора промывают дистиллированной водой, а один раз в неделю - 70 % раствором этилового спирта и снова дистиллированной водой.
  • Время между заполнением лунок промывающим раствором и удалением раствора не должно превышать 30 с. Нельзя допускать высыхания лунок после удаления из них раствора.
  • Раствор ФСРТ. Для получения рабочего раствора содержимое флакона с концентратом (х25) ФСРТ разводят в 480 мл дистиллированной воды.
    Хранение: рабочий раствор ФСРТ хранят до 6 мес при температуре (2 - 8) °С.
  • Растворы РРК, РИП: Готовы к применению
  • Контроли (К-, К+, НС, ИС): Готовы к применению.
  • Анализируемые образцы. Для анализа используют пробы, которые оказались положительными при исследовании тест-системой иммуноферментной для обнаружения антигенов ротавируса с подтверждением положителльных результатов "ИФА-Рота-антиген" производства НИИЭМ имени Пастера или скрининговых тест-систем других фирм-производителей.
    Пробы используются в цельном виде, если их оптическая плотность (ОП) не превышает 1,5 оптических единиц (о. е.).
    Пробы с ОП более 1,5 о. е. разводят с шагом 10 на растворе ФСРТ до 10-3 степени (1 : 10; 1 : 100; 1 : 1000).
    Хранение. Цельные и разведенные образцы хранят при температуре минус (10 - 20) °С до 6 мес. Замораживание - оттаивание допускается не более 2 раз.
  • Раствор коньюгата. Концентрат конъюгата (х20) разводят раствором РРК 1:20, добавляя к РРК концентрат конъюгата в объемах, определяемых количеством используемых стрипов (см. пример 1). Раствор конъюгата тщательно перемешивают.
    Пример 1

    Хранение: раствор конъюгата хранят не более 1 сут при температуре (2 - 8) °С.
  • Субстратный раствор. Готовят непосредственно перед употреблением. Используемая посуда и наконечники не должны содержать следов моющих средств, поскольку их присутствие ведет к появлению неконтролируемой окраски раствора. Необходимый объем субстратного раствора определяется числом используемых стрипов (см. пример 2). Для этого смешивают указанные объемы ТМБ и ЦБП. Каждый компонент отбирают отдельным наконечником и сливают реагенты в пластиковую посуду, предварительно ополоснутую дистиллированной водой. При приготовлении раствора избегать яркого света и прямых солнечных лучей. Субстратный раствор должен быть бесцветным или слегка голубоватым.
    Хранение: хранению не подлежит.

  • Пример 2
  • Раствор серной кислоты (Стоп-реагент). Готов к применению.

Проведение анализа

  • Гидратация иммобилизованных антиротавирусных антител. Во все лунки стрипов вносят по (200 - 300) мкл раствора ФСРТ. Инкубируют в течение (1 - 2) мин при температуре (18 - 25) °С, затем раствор из лунок удаляют с помощью автоматического промывателя (вошера) или вытряхивают.
    Будьте внимательны! Стрипы могут выпадать из рамки-держателя.
  • Внесение контролей и исследуемых проб. Одну из лунок (А1) оставляют незаполненной (контроль субстрата). В остальные лунки вносят по 75 мкл раствора РИП. Затем в две лунки вносят по 25 мкл раствора К+, в следующие две лунки - по 25 мкл раствора К-. При внесении К+ и К- раствор в лунках тщательно перемешивают пипетированием (не менее 3 раз). В остальные лунки вносят по 25 мкл исследуемых образцов, цельных и в разведениях, и также перемешивают. Затем в первую из парных лунок, включая лунки с К- и К+ , вносят по 10 мкл раствора НС, а во вторую из парных лунок - по 10 мкл раствора ИС. При внесении НС и ИС раствор тщательно пипетируют (не менее 3 раз). Планшет закрывают крышкой или помещают во влажный полиэтиленовый пакет и инкубируют в течение (60 ± 1) мин при температуре (37 ± 1) °С во влажной камере или в течение (30 ± 1) мин при температуре (37 ± 1) °С на шейкере с интенсивностью перемешивания (500 - 800) об/мин. Затем содержимое лунок удаляют и промывают лунки трехкратно раствором ФСРТ.
  • Внесение конъюгата. Во все лунки, кроме А1, вносят по 100 мкл раствора конъюгата. Планшет закрывают крышкой или помещают во влажный полиэтиленовый пакет и инкубируют в течение (60 ± 1) мин при температуре (37 ± 1 ) °С во влажной камере или в течение (30 ± 1) мин при температуре (37 ± 1) °С на шейкере с интенсивностью перемешивания (500 - 800) об/мин. Затем содержимое лунок удаляют и промывают лунки пятикратно раствором ФСРТ.
  • Проведение ферментативной реакции. Перед проведением ферментативной реакции планшет промывают один раз дистиллированной водой для удаления остатков раствора ФСРТ. Для этого во все лунки вносят по (200 - 300) мкл дистиллированной воды и выдерживают (1 - 2) мин при температуре (18 - 25) °С. Затем воду удаляют с помощью вошера или вытряхивают.
    Во все лунки планшета вносят по 100 мкл субстратного раствора. Планшет помещают в защищенное от света место и выдерживают (20 ± 1) мин при температуре от (18 - 25) °С.
  • Остановка ферментативной реакции. Реакцию останавливают внесением в каждую лунку по 50 мкл раствора стоп-реагента. Учет результатов проводят не позднее, чем через 30 мин после внесения раствора стоп-реагента.

Учет и интерпретация результатов

При правильном проведении всех стадий анализа содержимое лунок с контролем субстрата и К- должно оставаться бесцветным или бледно-желтым. В лунках с К+ интенсивность желтой окраски должна быть разной: в лунке с (К+ + НС) она более интенсивна, чем в лунке (К+ + ИС).

Визуальный учет

Исследуемая проба оценивается как положительная, если имеются отчетливые различия в интенсивности окраски раствора в парных лунках с исследуемой пробой, а именно: интенсивность окраски в первой лунке (исследуемая проба +НС) должна быть больше, чем во второй лунке (исследуемая проба +ИС).

Инструментальный учет

Учет результатов проводят путем измерения оптической плотности (ОП) при длине волны 450 нм непосредственно в лунках стрипов с помощью вертикального фотометра.

При проведении измерений осуществляют установку "нулевого" уровня ОП по лунке А1 ("бланк") с контролем субстратного раствора, что позволяет автоматически вычитать ОП в А1 из значений ОП во всех остальных лунках. Если установку "нулевого" уровня ОП проводят по воздуху, то значение ОП в лунке А1 не должно превышать 0,1 оптических единиц (о.е.).

Результаты учитываются, если среднее значение ОП в лунках (К- + НС) и (К- + ИС) не превышает 0,2 оптических единиц (о.е.), в лунке с (К+ + НС) быть не менее 0,5 о.е., а в лунке с (К+ + ИС) быть не более 50 % от значения ОП для лунки (К+ + НС).

Количественная оценка результатов проводится по формулам:

Если хотя бы в одном из разведений ОП (проба + НС) больше К(1), а значение К(2) больше 2.0, то считают, что проба содержит антигены ротавируса (положительный результат).

Если хотя бы в одном из разведений ОП (проба + НС) больше К(1), а значение К(2) меньше или равно 2.0, то считают, что проба не содержит антигены ротавируса (ложноположительный результат).

Примечание. Если значения ОП(проба + НС) и (или) ОП(проба + ИС) не могут быть зарегестрированы количественно ( "зашкал" прибора) или превышают 1,5 о. е., то анализ следует повторить, используя большие разведения образца (1:10000; 1:1000 000 и т. д.) на растворе ФСРТ.

Форма выпуска

Тест-систему иммуноферментную для обнаружения антигенов ротавируса с подтверждением положителльных результатов выпускают в виде комплекта, упакованного в коробку.

Условия хранения и транспортировки

  • Комплект тест-системы иммуноферментной для обнаружения антигенов ротавируса с подтверждением положителльных результатов хранить при температуре не выше 10 °С. Транспортировку тест-системы иммуноферментной для обнаружения антигенов ротавируса с подтверждением положителльных результатов осуществлять всеми видами крытого транспорта при температуре не выше 25 °С в течение не более 2 недель.
  • Срок годности тест-системы иммуноферментной для обнаружения антигенов ротавируса с подтверждением положителльных результатов - 12 месяцев со дня выпуска.
  • При нарушении условий хранения, транспортировки и схемы постановки ИФА рекламации не принимаются.

Главная ::  Каталог "Иммуноферментные тест-системы" ::  Список инструкций

ФБУН НИИ эпидемиологии
и микробиологии имени Пастера
Отдел новых технологий