Диагностикум эритроцитарный коревой антигенный сухой для реакции пассивной гемагглютинации (РПГА), комплект № 2 КЭД-90

Диагностикум эритроцитарный коревой антигенный сухой для реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) представляет собой 3 % акролеинизированные, танизированные бараньи эритроциты, сенсибилизированные дезинтегрированным коревым антигеном.

В состав набора входит:

  • диагностикум эритроцитарный коревой (КЭД) антигенный сухой 3 %, пористая однородная масса бежевого цвета - 5 фл. по 2 мл;
  • сыворотка кроличья нормальная (НКС) сухая 10 %, пористая однородная масса белого цвета - 5 фл. по 2 мл;
  • эритроциты барана, акролеинизированные или формалинизированные несенсибилизированные (суспензия 30 %), при встряхивании – гомогенная суспензия коричневого цвета; при отстаивании – два слоя: прозрачная или слегка опалесцирующая надосадочная жидкость желтоватого цвета и осадок коричневого цвета, разбивающийся при встряхивании - 1 фл. - 3 мл;
  • иммуноглобулин человека нормальный жидкий - положительный контрольный образец коревых антител с титром антител 1: 320 – 1:1280, соответствующим 50 МЕ/мл - 1 амп. - 1,5 мл.

Указанные реагенты упакованы в картонную коробку вместе с инструкцией по применению.

Один набор рассчитан для исследования 90 сывороток, не считая контролей.

Назначение диагностикума эритроцитарного коревого антигенного сухого

Выявление антител к вирусу кори в сыворотках крови людей и в препаратах иммуноглобулина человека.

Способ применения диагностикума

Диагностикум применяют в реакции пассивной гемагглютинации.

Для постановки реакции дополнительно требуются следующие материалы и оборудование:

  • дистиллированная вода;
  • раствор натрия хлорида, 0,9 %, рН 6,4 - 7,2;
  • спирт этиловый ректифицированный технический;
  • пипетки одноканальные для подачи жидкостей на 5 - 40 мкл, 40 - 200 мкл, 200 - 1000 мкл и 1000 - 5000 мкл;
  • пипетки 8- или 12-канальные для подачи жидкостей на 5 - 40 мкл и 40 - 200 мкл;
  • наконечники полипропиленовые на 5 - 200 мкл, 200 - 1000 мкл и 1000 - 5000 мкл;
  • пробирки центрифужные полипропиленовые или стеклянные вместимостью 10,0 мл;
  • мерные стаканы вместимостью 50,0 - 100,0 мл;
  • ванночки для реагентов или стеклянные чашки Петри;
  • планшеты однократного применения для иммунологических реакций (ТУ 64-2-278-79) с лунками вместимостью 0,20 - 0,25 мл и U-образным дном или планшеты из микротитратора системы Такачи тип ОХ-603/1 полистироловые, с лунками такой же вместимости с U-образным дном;
  • спиртовка СЛ-1 или СЛ-2;
  • бумага фильтровальная листовая для просушивания.

Для постановки реакции можно использовать микротитратор системы Такачи ОХ-603/1.

Приготовление растворов для постановки реакции пассивной гемагглютинации

Приготовление рабочего 1 % раствора НКС

Для разведения диагностикума, испытуемых сывороток и иммуноглобулина человека используют 1 % раствор НКС.

Во флакон с НКС вносят 2,0 мл дистиллированной воды и выдерживают при температуре от 16 до 25 °С в течение 1 мин. - получают 2,0 мл 10 % НКС. Затем 10 % НКС разводят в 10 раз 0,9 % раствором натрия хлорида - получают 1 % раствор НКС. Например: к 18,0 мл 0,9 % раствора натрия хлорида добавляют 2,0 мл 10 % раствора НКС.

Допускается хранение неиспользованного 10 % раствора НКС при температуре от минус 8 °С до минус 12 °С в течение 2 недель. 1 % раствор НКС хранят при температуре от 2 до 10 °С в течение 1 сут. Плохо растворившуюся сыворотку для реакции не используют.

Приготовление рабочей 1 % суспензии КЭД

Во флакон с диагностикумом добавляют 2,0 мл дистиллированной воды. В течение 1 мин. образуется гомогенная коричневая 3 % суспензия, которую оставляют при температуре от 16 до 25 °С на 2 ч для гидратации. При отстаивании образуется 2 слоя: прозрачная или слегка опалесцирующая надосадочная жидкость светло-желтого цвета и осадок коричневого цвета, разбивающийся при встряхивании. Для получения рабочей 1 % суспензии 3 % суспензию диагностикума разбавляют в 3 раза 1 % раствором НКС. Например: к 2,0 мл 3 % суспензии КЭД добавляют 4,0 мл 1 % раствора НКС.

Допускается хранение остатка 3 % суспензии диагностикума во флаконе при температуре от 2 до 10 °С в течение 24 ч. 1 % суспензия хранению не подлежит.

Приготовление 1 % суспензии акролеинизированных или формалинизированных эритроцитов барана

Для контроля испытуемых сывороток на полноту удаления бараньих изоагглютининов готовят 1 % суспензию эритроцитов из 30 % суспензии акролеинизированных или формалинизированных несенсибилизированных эритроцитов барана. После тщательного встряхивания к 0,1 мл 30 % суспензии эритроцитов добавляют 2,9 мл 0,9 % раствора натрия хлорида. Для контроля 90 сывороток необходимо не более 2,5 мл 1 % суспензии эритроцитов.

Допускается хранение остатка 1 % суспензии эритроцитов при температуре от 2 до 10 °С не более 7 сут.

Подготовка сывороток

Подготовка испытуемых сывороток

Испытуемые сыворотки должны быть прозрачными, светлыми, без признаков бактериального пророста и гемолиза. До серологического исследования их хранят при температуре от 2 до 10 °С или в замороженном состоянии при температуре минус 15 °С и ниже. Исследуемые сыворотки разводят 0,9 % раствором натрия хлорида 1:5 (к 0,1 мл нативной сыворотки добавляют 0,4 мл 0,9 % раствора натрия хлорида), прогревают при температуре 56 ± 1 °С в течение 1 ч и истощают 30 % суспезией акролеинизированных или формалинизированных несенсибилизированных эритроцитов барана, которые перед этим тщательно встряхивают. 30 % суспензию эритроцитов добавляют в разведенную и прогретую сыворотку из расчета 0,025 мл суспензии эритроцитов на 0,5 мл сыворотки, перемешивают и выдерживают при температуре 36 ± 1 °С в течение 1 ч или при температуре от 2 до 10 °С в течение 18 ч. Эритроциты осаждают центрифугированием при 1500 - 2000 об./мин. в течение 10 мин.

Приготовление положительного контроля - иммуноглобулина человека нормального

Иммуноглобулин человека нормальный разводят так же, как испытуемые сыворотки - 1:5. Для этого из ампулы, содержащей иммуноглобулин, стерильно забирают 0,1 мл, добавляют к 0,4 мл 0,9 % раствора натрия хлорида и используют в реакции без прогревания и обработки эритроцитами.

Неизрасходованный иммуноглобулин разливают стерильно в пробирки по 0,1 мл и плотно закрывают пробками.

Допускается хранение разлитого по пробиркам иммуноглобулина при температуре от 2 до 10 °С не более 20 сут.

Постановка реакции

Перед постановкой реакции лунки планшетов протирают влажным тампоном, смоченным 0,9 % раствором натрия хлорида.

Постановка реакции с использованием полистироловых планшетов и многоканальных пипеток

Для исследования 1 сыворотки используют 1 ряд лунок планшета.

В соответствии с количеством испытуемых сывороток в ряды планшета во все лунки многоканальной пипеткой вносят по 0,05 мл 1 % раствора НКС.

В первую и последнюю лунку каждого ряда вносят пипеткой по 0,05 мл подготовленных исследуемых сывороток и той же пипеткой, начиная с первой лунки, сыворотку перемешивают 5 раз и последовательно переносят во все лунки каждого ряда, кроме последней. Из последней лунки, в которой титровали сыворотку, удаляют 0,05 мл разведенной сыворотки. Разведение сывороток в первых и последних лунках получается, таким образом, 1:10.

Титрование иммуноглобулина человека нормального, входящего в комплект в качестве положительного контроля, производят точно так же, как испытуемых сывороток. Контроль иммуноглобулина ставят в 3-х параллельных рядах лунок планшета.

Во все лунки, кроме последней, каждого ряда многоканальной пипеткой вносят по 0,025 мл хорошо перемешанной 1 % суспензии диагностикума коревого эритроцитарного антигенного.

Обязателен контроль исследуемой сыворотки на полноту удаления бараньих изоагглютининов. Для этого в последние лунки каждого ряда, где содержатся по 0,05 мл исследуемой обработанной и разведенной 1:10 сыворотки, вносят по 0,025 мл хорошо перемешанной 1 % суспензии эритроцитов барана, приготовленной из 30 % суспензии формалинизированных или акролеинизированных несенсибилизированных эритроцитов барана.

Обязателен контроль КЭД на отсутствие его спонтанной агглютинации в 1 % растворе НКС. Для этого в 4 лунки планшета вносят по 0,05 мл 1 % НКС и 0,025 мл 1 % суспензии диагностикума.

Обязателен контроль акролеинизированных или формалинизированных несенсибилизированных эритроцитов барана на отсутствие неспецифической агглютинации в 1 % растворе НКС. Для этого в 4 лунки вносят по 0,05 мл 1 % НКС и 0,025 мл 1 % суспензии несенсибилизированных эритроцитов.

Планшет тщательно встряхивают и оставляют при температуре от 16 до 25 °С на 2 ч до полного оседания эритроцитов в контроле.

Постановка реакции с использованием микротитратора Такачи

Перед постановкой реакции большие петли (0,05 мл) микротитратора Такачи прожигают и используют после охлаждения.

Для исследования 1 сыворотки используют 1 ряд лунок планшета. В соответствии с количеством исследуемых сывороток в ряды планшета во все лунки пипеткой от микротитратора вносят по 0,05 мл 1 % раствора НКС.

В первую и последнюю лунки каждого ряда пипеткой от микротитратора вносят по 0,05 мл подготовленной исследуемой сыворотки, большой петлей, начиная с первой лунки, сыворотку перемешивают 5 раз и последовательно переносят во все лунки ряда, кроме последней. Из последней лунки, в которой титровали сыворотку, удаляют 0,05 мл разведенной сыворотки. Техника титрования описана в инструкции, прилагаемой к микротитратору. Разведение сыворотки в первых и последних лунках получается 1:10.

Титрование иммуноглобулина человека нормального, входящего в комплект в качестве положительного контроля, производят точно так же, как испытуемых сывороток. Контроль иммуноглобулина ставят в 3-х параллельных рядах лунок планшета.

Во все лунки, кроме последней, каждого ряда пипеткой от микротитратора вносят по 0,025 мл хорошо перемешанной 1 % суспензии КЭД.

Для контроля испытуемых сывороток на полноту удаления бараньих изоагглютининов в последние лунки каждого ряда вносят по 0,025 мл хорошо перемешанной 1 % суспензии эритроцитов, приготовленных из 30 % суспензии акролеинизированных или формалинизированных несенсибилизированных эритроцитов барана.

Обязателен контроль КЭД на отсутствие его спонтанной агглютинации в 1 % растворе НКС. Для этого в 4 лунки планшета вносят по 0,05 мл 1 % НКС и 0,025 мл 1 % суспензии диагностикума.

Обязателен контроль акролеинизированных или формалинизированных несенсибилизированных эритроцитов барана на отсутствие неспецифической агглютинации в 1 % растворе сыворотки кроличьей нормальной. Для этого в 4 лунки вносят по 0,05 мл 1 % НКС и 0,025 мл 1 % суспензии несенсибилизированных эритроцитов.

Планшет тщательно встряхивают и оставляют при температуре от 16 до 25 °С на 2 ч до полного оседания эритроцитов в контроле.

Учет результатов

Учет результатов проводят по условной шкале четырех крестов:

++++ (4+) - эритроциты образуют перевернутый "зонтик", края его опадают;
+++ (3+) - эритроциты образуют перевернутый "зонтик", края его ровные;
++ (2+) - по краю лунки намечается тонкое кольцо из эритроцитов;
+ (1+) - по краю лунки располагается широкое кольцо из эритроцитов;
(-) - эритроциты оседают на дне лунки в виде диска или кольца.

В последних лунках каждого ряда (контроль сыворотки), где добавлена 1 % суспензия формалинизированных или акролеинизированных несенсибилизированных эритроцитов барана, не должно быть агглютинации. При наличии агглютинации данная сыворотка должна быть повторно истощена.

В контрольных лунках с коревым эритроцитарным диагностикумом (контроль КЭД) в 1 % растворе НКС не должно быть агглютинации.

В контрольных лунках с акролеинизированными или формалинизированными несенсибилизированными эритроцитами в 1 % растворе НКС (контроль эритроцитов) не должно быть агглютинации.

Титром сыворотки или иммуноглобулина считают то последнее разведение, которое вызывает агглютинацию нагруженных коревым антигеном эритроцитов на два креста (++).

Сыворотки с титром 1:10 и выше расценивают как положительные.

При ретроспективной диагностике подтвержденным считают диагноз кори при наличии четырехкратного и более нарастания титра антител при титровании парных сывороток: 1-ая из которых получена не позднее 3-го дня с момента появления сыпи, а 2-ая - через 3 недели после получения первой.

Титр коревых антител в иммуноглобулине человека нормальном (положительный контрольный образец) в РПГА должен соответствовать указанному на коробке комплекта с диагностикумом и выражен величиной разведения и в МЕ/мл.

Титр коммерческих серий препарата иммуноглобулина устанавливают в Международных Единицах (МЕ).

Расчет титра коревых антител в препаратах иммуноглобулинов в МЕ производят по следующей формуле:

Х = (а*с)/в

где: Х - титр коревых антител в испытуемом иммуноглобулине в МЕ;
а - титр коревых антител в иммуноглобулине - положительном контрольном образце коревых антител в МЕ, указанный на этикетке;
в - титр коревых антител в иммуноглобулине – положительном контрольном образце коревых антител, выраженный величиной обратной разведению, полученный в данном опыте;
с - титр коревых антител в испытуемом иммуноглобулине, выраженный величиной обратной разведению, полученный в данном опыте.

Условия транспортирования и хранения. Срок годности

  • Транспортирование в соответствии с СП.3.3.2.1248-03 при температуре от 2 до 10 °С.
  • Хранение в соответствии с СП 3.3.2.1248-03 при температуре от 2 до 10 °С в сухом, защищенном от света, недоступном для детей месте.
  • Срок годности - 2 года. Препарат с истекшим сроком годности применению не подлежит.
  • Рекламации на качество диагностикума направлять в ФГУН ГИСК им. Л.А.Тарасевича Роспотребнадзора по адресу:
    119002, Москва, пер. Сивцев Вражек, д. 41, тел./факс (495) 241-39-22, 241-92-38,
    а также в адрес предприятия-изготовителя:
    Отдел новых технологий, ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, по адресу:
    197101, Санкт-Петербург, ул. Мира, д.14, ОНТ; телефакс (812) 233-17-03; телефон (812) 325-27-10;
    E-mail: dntpasteur@ya.ru;
    веб-сайт: www.dntpasteur.ru.

Главная :: Каталог "Агглютинационные тесты РПГА, РТГА, РА" :: Список инструкций

ФБУН НИИ эпидемиологии
и микробиологии имени Пастера
Отдел новых технологий