Селективно-дифференциальные среды для одноэтапного выделения и прямой идентификации "проблемных" энтеробактерий

Универсальные среды с 1905 года широко применяют в лабораторной практике для выделения энтеробактерий: Мак-Конки агар, эозин-метиленовый синий агар (Левина). Они обеспечивают также рост многих видов грамотрицательных бактерий других семейств и некоторых грамположительных бактерий (энтерококков).

Для выделения патогенных энтеробактерий (сальмонелл, шигелл, иерсиний, энтеропатогенных эшерихий) используется большой арсенал селективно-дифференциальных сред: сальмонелла-шигелла агар, гектоен-энтерик агар, дезоксихолат-цитратный агар, дезоксихолат-цитрат-лактоза-сульфит агар, ксилоза-лизин-дезоксихолат агар, бактоагар Плоскирева, висмут-сульфит агар, ЦИН-агар и др. Указанные среды не обеспечивают прямой идентификации бактерий, в связи с чем необходимо выделение их в чистой культуре и последующая идентификация широким набором тестов, что длительно и трудоемко.

Хромогенные среды

В целях ускорения исследования, значительного сокращения объема работы и материальных средств в последние годы разработана группа хромогенных питательных сред для одноэтапного выделения и прямой идентификации значимых в медицине ("проблемных") энтеробактерий. К проблемным энтеробактериям относятся сальмонеллы и другие возбудители острых диарейных инфекций, возбудители раневых и госпитальных инфекций (Esherihia coli, Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae, Proteus mirabilis). Эти же энтеробактерии важны для санитарной микробиологии.

Хромогенные среды основаны на выявлении специфических или уникальных ферментов микроорганизмов. Для обнаружения специфического фермента в состав среды включают хромогенные субстраты вещества, при расщеплении которых образуются окрашенные или флюоресцирующие продукты (светятся в УФ свете). В результате хромогенная среда контрастно изменяет свой цвет или флюоресцирует при обнаружении искомого микроорганизма. Большинство хромогенных сред содержат также селективные добавки, подавляющие рост нежелательных бактерий. При использовании хромогенных сред искомые бактерии ускоренно (в течение суток), одноэтапно выделяются и одновременно идентифицируются без проведения дальнейших, дополнительных тестов (или при помощи 1 - 2 тестов, выполняемых в течение нескольких часов в пределах первых суток).

По таксономическому уровню различают хромогенные среды групповой, родовой, видовой и внутривидовой идентификации. По завершенности исследования среды одноэтапной прямой идентификации подразделяют на среды первичной и окончательной идентификации.

Для прямой групповой идентификации колиформных бактерий и видовой идентификации E.coli в клиническом материале, воде, пищевых продуктах производятся среды Chromacult Coliform Agar (фирмы Mercк KGaA, Германия). Комбинацией двух хромогенных субстратов одновременно определяются колиформные бактерии и E.coli. Фермент β-галактозидаза, характерный для колиформных бактерий, расщепляет хромогенный субстрат SalmonGal, что приводит к окрашиванию колоний колиформных бактерий в розовый (красный) цвет. Фермент β-глюкуронидаза, характерный для E.coli, расщепляет хромогенный субстрат Х-глюкуронид. E.coli имеет оба фермента, поэтому их колонии окрашиваются в темно-синий (фиолетовый) цвет и четко отличаются от колоний колиформных бактерий. Рост грамположительных бактерий подавляется тергитолом-7. Для подтверждения E.coli необходима постановка теста на индол на чашке или микрообъемным методом. Однако среда не обладает полной специфичностью (около 5 % E.coli, в том числе E.coli 0157:Н7, не обладают β-галактозидазой, а некоторые штаммы шигелл, сальмонелл, иерсиний ее имеют).

Для прямой идентификации колиформных бактерий и E.coli в жидкой среде предназначена среда Fluorocult LMX (фирмы Mercк KGaA, Германия). Колиформные бактерии выявляются по расщеплению хромогенного субстрата X-Gal специфическим ферментом β-галактозидазой, в результате чего исходный цвет среды в пробирке меняется от светло-желтого до сине-зеленого. E.coli выявляются по расщеплению флюорогеннго субстрата MUG ферментом β-глюкуронидазой, в результате чего образуется флюоресцирующий в УФ-свете (366 нм) продукт реакции. Постановка теста на индол реактивом Ковача в той же пробирке надежно выявляет E.coli. Все исследование завершается в течение 18 - 20 ч после посева материала.

К хромогенным средам внутривидовой идентификации относятся питательные среды для выделения и идентификации энтерогеморрагической E.coli 0157:H7 Fluorocult HC Agar acc. tо SZABO и CT-Sorbitol MacConkey Agar (CT-SMAK Agar), производимые фирмой Merck (Германия). Среды предназначены для выделения этих бактерий из пищевых продуктов и клинического материала. В состав среды Fluorocult HC Agar acc. to SZABO входит сорбит с индикатором бромкрезоловый пурпурный и хромогенный субстрат 4-метилумбеллиферил-β-глюкуронид, который расщепляется β-глюкуронидазой с образованием флюоресцирующего 4-метилумбеллиферона. Грамположительная микрофлора подавляется солями желчных кислот. В отличие от остальных кишечных палочек E.coli 0157:H7 не ферментирует сорбит и не имеет β-глюкуронидазы. После инкубации посевов в течение 16 - 24 ч при температуре 41 °С учет проводят двухэтапно: вначале отмечают сорбит-отрицательные колонии (неокрашенные), затем облучают колонии ультрафиолетовым светом и отмечают нефлюоресцирующие колонии. Отобранные колонии (неокрашенные, нефлюоресцирующие) дополнительно тестируют агглютинирующими сыворотками к E.coli 0157:H7 или экспрессным иммунохроматографическим тестом Singlepath E.coli 0157 (Merck, Германия) в течение 20 минут. Питательная среда CT-SMAC Agar состоит из среды Мак-Конки, в которую добавляют сорбит и суплемент СТ (цефиксим и теллурит калия). После инкубации посевов в течение 16 - 24 ч при температуре 35 - 37 °С отмечают неокрашенные (сорбит-негативные) колонии и дополнительно тестируют их сыворотками к E.coli 0157:H7 или используют экспрессный иммунохроматографиченский тест Singlepath E.coli 0157 (Merck, Германия).

Для выделения и прямой родовой идентификации сальмонелл производится хромогенная среда Rambach Agar (Merck KGaA, Германия). В состав среды входит специфический для сальмонелл субстрат пропиленгликоль. Он ферментируется сальмонеллами до кислоты, действие которой на смесь рН-индикаторов окрашивает колонии сальмонелл в красный цвет. Колиформные бактерии образуют сине-зеленые колонии, шигеллы и протеи бесцветные, слегка желтоватые колонии. Дезоксихолат натрия ингибирует "роение" протея и грамположительную микрофлору. Исследуемый материал предварительно проходит этап подращивания на селективной среде обогащения для сальмонелл, затем высевается на ¼ чашки с Rambach-агаром. Учет результатов проводят через 24 ч инкубации при температуре 37 °С. Среда окончательно идентифицирует сальмонеллы с 99 % специфичности и 97 - 99 % чувствительности. Для ускоренного селективного выделения и обогащения сальмонелл из пищевых продуктов и объектов окружающей среды фирма Merck производит среды: DIASALM agar Salmonella, MSRV Agar Salmonella, Salmosyst Salmonella. После подращивания на этих средах идентификация сальмонелл проводится на среде RambachAgar.

Для выделения и прямой идентификации бактерий рода Salmonella в клиническом материале и пищевых продуктах фирма BioMerieux (Франция) производит хромогенную среду "SM-ID". Среда основана на комбинированном действии двух хромогенных субстратов (на β-глюкуронидазу и β-галактозидазу) в сочетании с индикатором нейтральным красным. Селективные факторы соли желчных кислот и бриллиантовый зеленый. Через 16 - 24 ч инкубации посевов колонии сальмонелл идентифицируются по розовой окраске (колонии прочих бактерий бесцветные, голубые или пурпуные). Идентификация недостаточно специфична: не определяются сальмонеллы подвида arizonae, сероваров gallinarum и pullorum; ложноположительными могут быть колонии некоторых штаммов эшерихий, шигелл, морганелл, иерсиний.

Для выделения и прямой идентификации сальмонелл в клиническом материале и пищевых продуктах фирма Merck (Германия) производит среду XLT4 Agar (ксилоза-лизин-тергитол-4 агар). Среда разработана Miller R.G., Tate C.R. в 1990 г. Селективным фактором среды является тергитол-4 (тетрадецилсульфат натрия), который добавляется на 1 л среды в количестве 4,6 мл 26 - 28 % раствора. В состав среды входят лизин, ксилоза, лактоза, сахароза, феноловый красный и другие компоненты. Индикация сальмонелл проводится по черной окраске колоний, обусловленной продукцией сероводорода, который образуется только в благоприятных щелочных условиях при ферментации лизина и отсутствии или малой интенсивности ферментации ксилозы, лактозы, сахарозы. Через 24 - 48 ч инкубации посевов при температуре 35 - 37 °С колонии микроорганизмов имеют следующий вид: сальмонелл - черные или красно-фиолетовые с черным центром; Citrobaсter freundii - желтые; протея - желтые, рост его угнетен; кишечной палочки - желтые; шигелл - бесцветные на красном фоне среды. Важно, что черную окраску колоний могут иметь бактерии Edwardsiella tarda, но они встречаются редко и легко отличимы дополнительным микрообъемным тестом на продукцию индола (3 ч).

К средам групповой идентификации относится питательная среда для выделения бактерий родов протеус, провиденция, морганелла, которая производится НПО "Питательные среды" (г. Махачкала). Среда разработана А.Ф.Мороз, Л.Д.Газимуратовой, Г.Е.Афиногеновым в 1978 г. Принцип ее действия состоит в использовании узкоселективного действия поверхностноактивного вещества амфотерного класса "амфолана" (хлоргидрат алкилэтилглицина) в концентрации 0,125 %, допускающего рост только бактерий групп: протеус, провиденция, морганелла. С использованием среды выделяются указанные бактерии одноэтапно через 24 ч. По нашей информации среда обладает неполной специфичностью (допускается рост отдельных штаммов клебсиелл и серраций) и угнетает рост 10 - 15 % штаммов Proteus mirabilis и Providencia. Поэтому необходимо дополнительное изучение колоний микрообъемным тестом на триптофандезаминазу в течение 3 ч.

Назад

ФБУН НИИ эпидемиологии
и микробиологии имени Пастера
Отдел новых технологий