Хромогенные питательные среды

История питательных сред имеет многовековой опыт. Начинается она с открытия Л. Пастера. В 1861 году он доказал, что брожение есть процесс, тесно связанный с жизнедеятельностью дрожжевых грибков, которые питаются и размножаются за счёт бродящей жидкости, т.е. положил начало культивированию в жидких средах.

Л. Пастер

В 1883 году Р. Кох разработал метод выделения чистых культур микробов путем посева на пластинки желатина. Другой состав плотной питательной среды, который используется до сих пор, предложил в 1884 году немецкий микробиолог В. Хессе. Основным компонентом этой среды был агар-агар, который его жена использовала для приготовления фруктового желе.

Осталось только найти форму, в которую удобно заливать плотные среды, и наблюдать за ростом микробов. Такая форма в виде донышка, отрезанного от лабораторной бутыли, была предложена в 1887 году Ю. Петри и получила название - чашка Петри. Эти открытия положили основу для разработки, а затем промышленного выпуска и широкого практического использования жидких, полужидких и плотных питательных сред, которые, так же как и чашки Петри, до сих пор являются неотъемлемым атрибутом каждой микробиологической лаборатории.

чашка Петри

В 1905 году бактериолог А. Мак-Конки разработал первую хромогенную среду. В ее состав входят селективные компоненты (кристаллический фиолетовый и соли желчных кислот), которые ингибируют рост грам-положительных микробов, и специфический субстрат – лактоза. Кишечные бактерии ферментируют лактозу, что приводит к понижению рН среды и изменению цвета рН-индикатора – нейтрально красного. В результате колонии сальмонелл, шигелл и колиформных бактерий имеют красный цвет и окружены мутной зоной преципитации желчных солей.

агар Мак-Конки

В настоящее время хромогенные питательные среды получают в мировой бактериологической практике все более широкое применение. Из основных производителей следует назвать Oxoid, Merck, bio Merieux, HiMedia, Fluka, Sifin, Biolife. Выпуск освоен и отечественными производителями: НПП "Питательные среды" (г. Махачкала), ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии (г. Оболенск), НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера (г. Санкт-Петербург) и др.

Принцип действия и классификация

Слово хромоген является комбинацией двух греческих слов: chroma (chromatos) - цвет и genes – порождающий. Принцип действия хромогенных питательных сред заключается в образовании окрашенных веществ (индикаторов) в результате взаимодействия высокоспецифичных ферментов бактерий с компонентами среды. В зависимости от консистенции их делят на жидкие и плотные.

Жидкие среды

В жидких хромогенных питательных средах индикаторами служат субстраты ферментов, редокс-индикаторы или рН-индикаторы. Дифференциальные свойства таких сред значительно ослаблены тем, что протеолитические, окислительно-восстановительные или сахаролитические ферменты микроорганизмов весьма многообразны и универсальны, т.е. часто встречаются у микроорганизмов разных видов. Поэтому основной акцент при их разработке делается на повышение селективности, позволяющей доводить идентификацию бактерий до рода или вида.

Примером среды, основанной на способности микробов ферментировать неокрашенный субстрат в окрашенный, является хромогенный бульон на энтерококки фирмы Merck. Содержащийся в бульоне субстрат (5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-D-глюкопиранозид) под действием бета-D-глюкозидазы энтерококков и D-стрептококков образует растворимый продукт сине-зеленого цвета. Рост сопутствующих грамм-отрицательных бактерий (колиформные бактерии), также имеющих бета-D-глюкозидазы, подавляется наличием в бульоне азида натрия.

рост Enterococcus faecalis

Тест-штаммы Рост Сине-зеленый цвет среды
Enterococcus faecalis ATCC 11700 Средний/хороший +
Enterococcus faecalis ATCC 19433 Средний/хороший +
Enterococcus faecium ATCC 6057 Средний/хороший +
Streptococcus bovis DSMZ 30187 Средний/хороший +
Staphylococcus aureus ATCC 25923 Средний/хороший -
Aeromonas hydrophila DSZM 30187 Слабый -
Escherichia coli ATCC 25922 Роста нет -
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Роста нет -

Примером жидкой питательной среды, основанной на изменении цвета редокс-индикатора, может служить «Набор реагентов для определения чувствительности грибов рода Candida к антимикотикам» («Микотест-АЧ»), разработанный и выпускаемый НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера (г. Санкт-Петербург). Механизм действия основан на восстановлении резазурина (синий раствор) до резофурина (флуоресцирующий розовый раствор). Наличие в среде фенолового красного и селективных компонентов обеспечивает четкое изменение окраски от лилового цвета до желтого в случае роста грибов рода Candida. Наличие селективных компонентов подавляет рост грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов.

Микотест-АЧ

Наиболее широкое практическое применение нашли среды с рН-индикаторами. Их механизм действия основан на изменении окраски индикатора при изменении рН среды. Ферментация аминокислот или аммиака приводит к защелачиванию среды, а ферментация сахаров - к закислению.

В качестве примера можно привести хромогенные селективные питательное среды для одновременного выделения, идентификации и определения титра урогенитальных микоплазм (питательная среда «Микоплазма-50» для Mycoplasma hominis и питательная среда «Уреаплазма-50» для Ureaplasma urealyticum), разработанные и выпускаемые в НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера (г. Санкт-Петербург). Их механизм действия основан на повышении рН среды при ферментации мочевины («Уреаплазма-50») или аргинина («Микоплазма-50»). В результате, при наличии в исследуемой пробе Mycoplasma hominis цвет меняется с зеленого на фиолетовый, а при наличии в исследуемой пробе Ureaplasma urealyticum - с желтого на красно-малиновый.

Фотографии тест-систем

Микоплазма-50

Уреаплазма-50

Видеоинструкция к тест-системе «Уреаплазма-50»

Фотографии «Уреаплазма-50»

Уреаплазма-50

Видеоинструкция к тест-системе «Микоплазма-АЧ-12»

Фотографии «Микоплазма-АЧ-12»

Микоплазма-АЧ-12

Микоплазма-АЧ-12

Видеоинструкция к тест-системе «Уреаплазма-АЧ-12»

Фотографии «Уреаплазма-АЧ-12»

Уреаплазма-АЧ-12

Уреаплазма-АЧ-12

Плотные среды

Механизм действия плотных сред также заключается во взаимодействии высокоспецифичных ферментов бактерий с хромогенным субстратом, введённым в состав среды и играющим в ней роль индикатора. Однако, если в жидких средах продукты ферментации субстрата водорастворимы, что изменяет цвет всей среды, то в плотных средах они не растворимы, и изменяется только цвет колоний микроорганизмов.

Плотные хромогенные питательные среды имеют значительные преимущества по сравнению с жидким средами. Во-первых, идентификация возбудителя происходит одновременно с его выделением и не требует проведения предварительных посевов с целью получения чистой культуры. Во-вторых, можно оценить спектр патогенов в пробе и их относительное количество. В-третьих, требования к селективности плотных сред ниже, чем требования к селективности жидких сред, что позволяет идентифицировать на них широкий спектр микроорганизмов, принадлежащих к разным родам и видам.

Все материалы

ФБУН НИИ эпидемиологии
и микробиологии имени Пастера
Отдел новых технологий