Микрообъемная биохимическая идентификация энтеробактерий

В лабораторной практике идентификация видов и биоваров энтеробактерий проводится по их фенотипическим признакам. Основным и наиболее сложным разделом идентификации является изучение биохимических свойств бактерий. Повсеместно за рубежом и во многих лабораториях нашей страны биохимическая идентификация бактерий осуществляется микрообъемной технологией. При этом используются специальные микрообъемные тест-системы для автоматических бактериологических анализаторов или различные коммерческие тест-системы биохимической идентификации бактерий для визуального учета. Микрообъемная технология наиболее экономична, проста, пригодна для автоматизации и стандартизации исследований.

Автоматические бактериологические анализаторы для микрообъемной биохимической идентификации бактерий и определения их чувствительности кантибиотикам производятся фирмой "Bio Merieux" (Франция): "Vitek-2" - полностью автоматизированная система для идентификации 99 видов энтеробактерий и неферментирующих бактерий; полуавтоматические системы "АТВ Expression" и "Mini API" на основе тест-системы "ID 32E" для идентификации за 24 ч 99 видов энтеробактерий и тест-системы "Rapid ID 32Е" для идентификации за 4 ч 73 видов энтеробактерий. Компания "Dade AG" (США) выпускает автоматические бактериологические анализаторы "Walk-Away-40", "Walk-Away-96" и полуавтоматический бактериологический анализатор "Auto SCAN-4". Применяются автоматические анализаторы других фирм: Quantum II, Cobas Micro. Указанные приборы имеют высокую стоимость, что ограничивает их применение.

Коммерческие микрообъемные тест-системы по устройству представлены двумя группами: содержащими субстрат реакции в питательной среде или в шаблоне-носителе. Результаты биохимических тестов учитываются визуально, вид микроорганизма устанавливается с помощью таблицы идентификации, кодов (профилей) или компьютерных программ.

Среди тест-систем, основанных на принципе "субстрат в питательной среде" широко используются: API 20E "Bio Merieux" (Франция); Enterotest I и Enterotest 2, Enterotest 16, Entero-Screen (АО "Lachema", Чехия), мультимикротесты ММТЕ I и ММТЕ 2 (НПО "Аллерген" г. Ставрополь); ПБДЭ (НПО "Диагностические системы" г. Нижний Новгород); "РАПИД-ЭНТЕРО - 200" и "РАПИД-ЭНТЕРО - 50" (НИИЭМ имени Пастера, отдел новых технологий, г. Санкт-Петербург).

К системам типа "субстрат в шаблоне носителя" относятся коммерческие тест-системы Micro - ID, Minitek, в которых субстрат и индикатор находятся на бумажных дисках, которые вносят в лунки планшетов с суспензией бактерий.

Тест-система API 20E "Bio Merieux" (Франция) предназначена для биохимической идентификации энтеробактерий и других грамотрицательных палочек в течение 18 - 24 ч. Состоит из прозрачной полимерной пластинки с 20 микропробирками объемом 0,25 мл, содержащими дегидратированные субстраты для определения 20 тестов: β-галактозидазы, аргининдигидролазы, лизиндекарбоксилазы, орнитиндекарбоксилазы, уреазы, триптофандезаминазы, желатиназы; образования индола, сероводорода, ацетоина; ферментации цитрата, глюкозы, маннитола, инозитола, сорбитола, амигдалина, рамнозы, сахарозы, мелецитозы, арабинозы. Дополнительно вне панели определяют цитохромоксидазу, окисление и ферментацию глюкозы, подвижность. В состав комплекта входят также реактивы для определения индола, триптофандезаминазы, ацетоина, нитритов, оксидазы. Для исследования берут изолированную колонию со среды первичного посева, ставят пробу на оксидазу, готовят из колонии суспензию бактерий определенной мутности по шкале Мак-Фарланда. Вносят во все микропробирки по 100 мкл суспензии бактерий, затем добавляют по 50 мкл вазелинового масла в микропробирки с тестами на уреазу, лизиндекарбоксилазу, орнитиндекарбоксилазу, аргининдигидролазу, сероводорода. Посевы инкубируют при 36 °С в течение 18 - 24 ч, после чего добавляют реактивы на ацетоин, индол, триптофандезаминазу, нитриты. Результаты учитывают визуально, заполняют бланки с кодами цифрового профиля. Идентификацию проводят по кодам или идентификационной таблице. Если на панели нет ферментации глюкозы и менее двух положительных прочих тестов, ставят ОФ тест, определяют подвижность и продлевают наблюдение еще 24 ч для выявления неферментирующих бактерий.

Тест-система Rapid 20E (Bio Merieux) предназначена для биохимической идентификации энтеробактерий и других грамотрицательных палочек в течение 4 ч. Состоит из прозрачной полимерной пластинки с 20 микропробирками, содержащими дегидратированные субстраты для определения 20 тестов: β-D-галактозидазы, лизиндекарбоксилазы, орнитидекарбоксилазы, уреазы; образования индола, ацетоина; ферментации цитрата, эскулина, маннитола, арабинозы, ксилозы, адонитола, рамнозы, целлобиозы, мелецитозы, сахарозы, трегалозы, рафинозы, глюкозы. Исследования проводят так же, как тест-системой API 20E. Результаты учитывают через 4 ч инкубации при 36 °С. Вид бактерий идентифицируют по кодам.

Тест-система Enterotest 1 и 2 (АО "Lachema") предназначена для определения биохимической активности и идентификации наиболее важных энтеробактерий в течение 18 - 24 ч. Состоит из двух полимерных планшетов 8,5 х 12,5 см содержащих по 96 ячеек с высушенными питательными средами с субстратами для определения 23 биохимических тестов. Enterotest 1 для родовой идентификации позволяет определять 12 тестов: уреазу, β-D-галактозидазу, липазу, фенилаланиндезаминазу, орнитиндекарбоксилазу, лизиндекарбоксилазу; образование индола, сероводорода, ацетоина; ферментацию маннитола, цитрата, инозитола. Enterotest 2 для видовой идентификации определяет 11 тестов: ферментацию адонитола, эскулина, малоната натрия, рамнозы, целлобиозы, сахарозы, сорбитола, глюкозы, дульцитола, трегалозы и аргининдигидролазу. Имеются также среда и реактивы для определения вне планшетов оксидазы и О/Ф теста с глюкозой, а также набор реактивов для тестов в планшетах. Исследуемую чистую культуру-колонию со среды первичного посева (Мак-Конки агара, Эндо или других) изучают на оксидазу с помощью полосок окси-тест и ставят О/Ф тест на ферментацию глюкозы (в пробирках). Из изолированной колонии готовят суспензию в физиологическом растворе, равную степени № 1 по шкале мутности Мак-Фарланда. Делают высев суспензии для проверки чистоты культуры на кровяной агар. По 100 мкл суспензии бактерий вносят во все 23 лунки двух планшетов, заливают вазелиновым маслом лунки тестов на лизин, индол, сероводород, орнитин, уреазу, аргинин. Инкубируют планшеты в пакете из полиэтилена при 35 - 37 °С в течение (18 - 24) ч. Затем вносят в лунки реактивы на индол, ацетоин, фенилаланин. Учитывают визуально все результаты тестов, в том числе О/Ф теста. Идентификацию проводят с помощью идентификационных таблиц.

Система Enterotest 16 (АО "Lachema") предназначена для идентификации наиболее значимых в медицине энтеробактерий в течение 18 - 24 ч. Состоит из двух рядов (по 8 лунок) стрипированного 96-луночного планшета. В лунках содержатся вышеуказанные среды для определения 16 тестов: уреазы, фенилаланиндезаминазы, лизиндекарбоксилазы, орнитиндекарбоксилазы; образования индола, сероводорода; ферментации цитрата, эскулина, малоната, инозитола, адонитола, целлобиозы, сахарозы, сорбитола, маннитола, трегалозы. Имеются дополнительно идентификационные полоски Микро-Ла-Тест: ОКСИ тест - для выявления цитохромоксидазы, ОНП тест - на бета-галактозидазу, КОЛИ тест - на β-D-глюкуронидазу, ВП тест - на ацетоин; набор реактивов. Исследуют изолированные колонии со сред первичного посева (Эндо, Мак-Конки). Предварительно ставят тест на цитохромоксидазу с полоской ОКСИ тест и О/Ф-тест с глюкозой. Из изолированной колонии со среды Эндо или Мак-Конки готовят суспензию на физиологическом растворе степени № 1 по шкале Мак-Фарланда. Проводят контрольный высев суспензии на чистоту на кровяной агар. Вносят по 100 мкл суспензии бактерий в лунки двух рядов стрипов (16 лунок), добавляют вазелиновое масло в необходимые лунки, вносят полоски ОНП тест, КОЛИ тест, ВП тест в пробирки с суспензией бактерий, инкубируют при 35 - 37 °С в течение 18 - 24 ч. Учитывают все тесты и заносят в бланки. Идентификацию проводят с помощью идентификационных таблиц или книг кодов.

Система мультимикротестов Entero-Screen (АО "Lachema") предназначена для ускоренной идентификации сальмонелл в пищевой промышленности и санитарно-эпидемиологической службе, для идентификации наиболее часто встречающихся энтеробактерий в моче или другом клиническом материале в течение 4 ч. Система представляет собой стрипированный полимерный планшет из 96 лунок, содержащий в каждом из 12 стрипов (по 8 лунок) вышеуказанные среды для 8 ключевых тестов: уреазы, лизиндекарбоксилазы, орнитиндекарбоксилазы, фенилаланиндезаминазы; образование индола, ацетоина; ферментации глюкозы, сахарозы. Дополнительно имеются бумажные полоски: 0X1 test - на цитохромоксидазу, SALM test - на обнаружение сальмонелл, COLI test - на обнаружение Е.coli, PYR test - на выявление пирролидониламидазы.

Для обнаружения присутствия сальмонелл методом скрининга рекомендуется предварительно провести SALM test. Этот тест основан на выявлении С8-эстеразы по гидролизу 4-метилумбеллиферилкаприлата с образованием 4-метилумбеллиферрона, который выявляется при УФ облучении по синей флюоресценции. Исследуют колонию бактерий со среды первичного посева (Эндо, Мак-Конки, но не висмут-сульфит агар). Добавляют в зону индикации полоски 10 мкл реактива SALM test, втирают петлей культуру в зону с реактивом, инкубируют в течение 10 - 15 мин. при комнатной температуре, учитывают результат в темной комнате под УФ лампой с длиной волны 360 нм - положительная реакция проявляется появлением синей флюоресценции в зоне полоски. В контроле (без посева культуры) флюоресценция отсутствует. Штаммы с положительной реакцией подтверждают дальнейшим исследованием набором Entero-Screen. Следует отметить, что SALM test недостаточно специфичен: кроме сальмонелл положительный результат дают все штаммы Serratia marcescens, Stenotrophomonas maltophilia, многие штаммы Acinetobactersp., Pseudomonas aeruginosa.

Для исследования системой Entero-Screen используют чистую культуру, выросшую на среде Эндо, Мак-Конки агаре или агаре с кровью барана. Проводят микроскопию с окраской по Граму и тест на оксидазу (OXI test). Готовят суспензию 3-й степени мутности по Мак-Фарланду. Высевают часть суспензии для проверки чистоты культуры на неселективную среду (24 ч, 37 °С). Вносят по 100 мкл суспензии бактерий во все лунки стрипа, добавляют парафиновое масло в лунки с лизином, орнитином, мочевиной, глюкозой, средой на индол. Инкубируют в течение 4 ч при температуре 35 - 37 °С. Добавляют реактивы на индол, ацетоин, фенилаланиндезаминазу. Учитывают результаты и идентифицируют культуры по таблице идентификации. Идентификацию бактерий из мочи дополняют использованием COLI test. COLI test основан на выявлении β-D-глюкуронидазы по расщеплению 4-метилумбеллиферрил-Д-глюкуронида с высвобождением 4-метилумбеллиферрона, который дает голубую флюоресценцию в УФ лучах. Из исследуемых бактерий готовят суспензию на физиологическом растворе в объеме 1 мл мутностью № 3 по Мак-Фарланду; помещают полоску COLI test в пробирку с суспензией, инкубируют 4 ч при 37 °С, учитывают результат в темной комнате при УФ облучении по появлению голубой флюоресценции суспензии (положительный результат). Затем в пробирку с суспензией добавляют 4 капли реактива на индол (при положительной реакции появится красное кольцо). Положительный тест COLI test имеют около 95 % штаммов Е.coli, положительный тест на индол повышает возможность идентификации Е.coli.

Системы мультимикротестов ММТЕ 1 и ММТЕ 2 (НПО "Аллерген" г. Ставрополь) предназначены для идентификации наиболее распространенных энтеробактерий в течение 18 - 24 ч. Они представляют собой прозрачные полистироловые 96-луночные планшеты, в лунки которых помещены субстратно-индикаторные среды, стабилизированные поливиниловым спиртом и стерилизованные ультрафиолетовым облучением. Система ММТЕ 1 для родовой идентификации позволяет определять 12 тестов: образование индола, сероводорода; наличие лизиндекарбоксилазы, орнитин-декарбоксилазы, уреазы, фенилаланиндезаминазы; ферментацию маннитола, цитрата, малоната, сахарозы, лактозы, сорбитола. ММТЕ 2 дополняет ММТЕ 1 и служит для видовой идентификации по дополнительным 12 тестам: наличие аргининдигидролазы, β-D-галактозидазы, нитратредуктазы; ферментации инозитола, дульцитола, арабинозы, рамнозы, мальтозы, адонита, раффинозы, глюкозы, салицина. В состав набора входят также реактивы для соответствующих тестов. Выделяют чистую культуру на среде Эндо или кровяном агаре. Ставят тест на ферментацию глюкозы (О/Ф тест) на среде Хью-Лейфсона. Из чистой 24 ч культуры грамотрицательных бактерий готовят суспензию мутности № 2 по шкале Мак-Фарланда. Делают контрольный высев суспензии на кровяной агар для проверки чистоты культуры и дополнительных тестов. Вносят по 150 мкл суспензии в каждую лунку систем, добавляют вазелиновое масло в лунки на индол, сероводород, уреазу, лизин, орнитин, аргинин. Инкубируют посевы при 35 - 37 °С в течение 18 - 24 ч. Затем вносят в соответствующие лунки реактивы на индол, фенилаланиндезаминазу, нитриты. Учитывают все тесты, включая О/Ф тест. Идентификацию проводят по таблице идентификации. Разработана компьютерная программа идентификации.

Общим, недостатком всех рассмотренных тест-систем (API 20E, Rapid 20E, Enterotest I и Enterotest 2, Enterotest 16, Entero-Screen, MMTE 1 и ММТЕ 2), является необоснованный перерасход тест-систем, ввиду отсутствия предварительного отбора культур по тесту ферментации глюкозы или позднего учета О/Ф теста с глюкозой (уже после использования тест-систем).

Система ПБДЭ - пластина биохимическая, дифференцирующая энтеробактерии (НПО "Диагностические системы", г. Нижний Новгород) предназначена для биохимической идентификации энтеробактерий в течение 18 - 24 ч, представляет собой полимерную пластину с 20 лунками, содержащими высушенные среды с субстратами для 20 тестов: выявление уреазы, β-D-галактозидазы, лизиндекарбоксилазы, орнитиндекарбоксилазы, аргининдигидролазы; образования сероводорода, индола, ацетоина; ферментацию глюкозы, сахарозы, маннита, малоната, цитрата, цитрата натрия с глюкозой, инозитола, сорбитола, арабинозы, мальтозы. Пластина помещена в полимерный пенал. Исследуемую колонию со среды первичного посева отсевают на скошенный МПА, микроскопируют при окраске по Граму отсевают в пробирки со средой Олькеницкого и полужидким МПА (на подвижность).

Чистую культуру бактерий со скошенного МПА суспензируют в физиологическом растворе и вносят по 100 мкл суспензии во все лунки пластины, добавляют в соответствующие лунки вазелиновое масло. Пластину в пенале инкубируют при 35 - 37 °С в течение 18 - 24 ч. Затем добавляют реактивы в соответствующие лунки и учитывают результаты. Результаты вносят в кодовую карточку. Идентификацию проводят по каталогу кодов.

Тест-система "РАПИД-ЭНТЕРО - 200" (НИИЭМ имени Пастера, отдел новых технологий, г. Санкт-Петербург) предназначена для быстрой 4 ч биохимической идентификации наиболее часто встречающихся в медицинской практике видов энтеробактерий - возбудителей гнойно-септических и острых кишечных инфекций. Тест-система рассчитана на исследование 200 культур бактерий.

Комплект состоит из флаконов с полимерными капельницами, содержащих по 22 мл жидких дифференциальных сред; флаконов с капельницами, содержащих по 22 мл реактивов, и стерильных полистироловых 96-луночных планшетов длямикротитрования однократного применения с крышками. Тест-система обеспечивает постановку 13 тестов: выявление уреазы, триптофандезаминазы, индола, эскулина, лизиндекарбоксилазы, орнитиндекарбоксилазы, нитратредуктазы; ферментации лактозы, сахарозы, маннитола, маннозы, арабинозы, адонитола. Исследованию подлежат чистые культуры, выросшие из отсевов колоний со сред выделения на секторах питательного агара (или питательного агара с желчью). Предварительно определяют их возможную принадлежность к семейству энтеробактерий экспресс- тестом на цитохромоксидазу, тестом "тяжа" на грамотрицательные бактерии, ферментацию глюкозы на среде Клиглера. На среде Клиглера учитывают также газообразование при ферментации углеводов и образование сероводорода. Дальнейшему исследованию подлежат грамотрицательные, оксидазонегативные, ферментирующие глюкозу бактерии. Дифференциальные среды во флаконах готовы к немедленному использованию. Для их применения срезают ножницами с соблюдением стерильности верхний закрытый край полимерной капельницы и закрывают отверстие съемным колпачком капельницы. При исследованиях среда из флакона выдавливается по каплям путем надавливания пальцами на эластичные стенки капельницы. Дифференциальные среды вносят в планшеты по 4 капли (100 мкл) в лунку. Среды для одной культуры размещают в одном горизонтальном ряду из 12 лунок в постоянной последовательности (в одной лунке с маннитом содержится и субстрат на нитратредуктазу).

Количество рядов соответствует количеству культур, плюс один ряд контрольный (без посева). Агаровую культуру изучаемых бактерий вносят по полной стандартной петле в каждую лунку со средой и размешивают. Петлю прожигают только в начале и конце посева на весь ряд. На поверхность сред с мочевиной, лизином и орнитином после посева вносят по 2 капли стерильного вазелинового масла. Закрытые крышками планшеты инкубируют при 37 °С. Предварительный учет результатов на среде с мочевиной проводят через 2 мин. и через 1 ч, на среде с лизином - через 2 ч. Через 4 ч после посева добавляют в лунки реактивы на триптофандезаминазу, индол, нитратредуктазу и окончательно учитывают результаты визуально по изменения окраски сред. Результаты вносят в бланки регистрации. Идентификацию культур проводят по таблице идентификации.

Специфичность (достоверность) идентификации энтеробактерий тест-системой составляет 97,6 ± 0,6 %. Диагностическая чувствительность: идентификация 96 ± 0,5 % изолятов энтеробактерий. Это единственная отечественная тест-система ускоренной идентификации энтеробактерий. Она наиболее экономична, обеспечивает большой объем исследований, проста и надежна в использовании. Стоимость одного исследования существенно дешевле, чем всеми другими тест-системами.

Выпускается также вариант тест-системы "РАПИД-ЭНТЕРО-50" на 50 исследований.

Для идентификации редких видов энтеробактерий, не предусмотренных тест-системами, применяют дополнительные тесты в соответствии с видовой характеристикой энтеробактерий, указанной в определителе бактерий Берджи (см. Приложение).

Обозначения:

"+<1" - положительный результат за 2 минуты;
"+1" - положительный результат за 1 час;
"+2" - положительный результат за 2 часа;
"+" - положительный результат за 4 часа;
"+/-" - положительный результат у более 50 % штаммов;
"-/+" - положительный результат у менее 50 % штаммов;
"-" - отрицательный результат;
* - образуют сероводород на среде Клиглера.

Приложение

Определитель видов бактерий семейства Enterobacteriaceae*

Обозначения:

1.
"-" - 0 - 10 % штаммов положительные;
( - ) - 11 - 25 % штаммов положительные;
а - 26 - 75 % штаммов положительные;
(+) - 76 - 89 % штаммов положительные;
"+" - 90 - 100 % штаммов положительные;
пропуск - нет данных.

Данные получены для срока инкубации 48 ч. Тесты проводили при 36 °С кроме реакций, для которых температура указана в колонке "Тесты", а также видов Xenorhabdus Erwinia, с которыми тесты проводили при 25 °С и 27 °С соответственно.

2. Нет данных.

3. Нет данных.

4. ОНПГ - о-нитрофенил-β-D-галактопиранозид.

5. Y желтый; R красный; В коричневый; О оранжевый.

6. F брожение.

*По "Определителю бактерий Берджи", ред. Дж. Хоулт, 9-е издание., Т.1-М.: Мир, 1997 с дополнениями.

Назад

ФБУН НИИ эпидемиологии
и микробиологии имени Пастера
Отдел новых технологий