Методы физической сорбции

Физическая сорбция специфического реагента на твердой фазе происходит за счет гидрофобных, донорно-акцепторных взаимодействий или водородных связей. Величина отрицательного поверхностного заряда твердой фазы не коррелирует с интенсивностью взаимодействия пластик белок, что указывает на отсутствие электростатической адсорбции [41].

Изучение изотерм адсорбции показало [3], что при взаимодействии белка с полимером вначале образуется мономолекулярный слой, при этом конформация белка не претерпевает заметных денатурационных изменений. Избыток белка приводит к многослойной сорбции за счет белок-белковых взаимодействий.

Многослойная сорбция должна быть сведена к минимуму. В противном случае слабо связанный специфический реагент реагирует с добавляемыми иммунореактантами и образующийся комплекс удаляется после каждого этапа промывки. Это приводит к уменьшению чувствительности анализа и увеличению разброса результатов. Количество десорбированного реагента может составлять до 60 - 70 % от первоначального [38]. Устранение многослойной сорбции достигается за счет многократной промывки твердой фазы. Вторым подходом, уменьшающим многослойную сорбцию, является использование оптимальной концентрации специфического реагента, которая лежит, например, для IgG в интервале 1 - 10мкг/мл.

Количество сорбированного белка, а тем самым и чувствительность анализа. определяется природой твердой фазы и природой (гидрофобностью) специфического реагента [13]. Гладкие полимерные поверхности полистирола, поливинилхлорида, полипропилена и др., выполненные в виде 96-луночных планшетов, шариков, пробирок и других литьевых форм обладают удовлетворительной сорбционной емкостью, составляющей 1,5 - 4 нг/мм2 [12, 40].

Более высокую сорбционную емкость имеют суспензии за счет увеличения суммарной поверхности [22]. Гораздо большей сорбционной способностью обладают пористые мембраны из нитроцеллюлозы или полиамидов [66].

Внутри каждого типа твердых фаз существуют различия в сорбционной емкости, обусловленные различиями состава и технологии получения. Так изучение 11 видов планшетов от 4 фирм позволило разделить их на 2 типа, один из которых плохо сорбирует, а второй хорошо сорбирует альбумин. IgG хорошо сорбируют оба типа планшетов [32]. Отличаются друг от друга не только планшеты разных типов, но и внутри одного типа, а также лунки одного и того же планшета [57]. Коэффициент вариации составляет около 5 % для лунок и до 30 % для планшетов одной и той же партии [33].

Величина гидрофобности сорбируемого белка зависит не только от его природы, но и от рН, ионной силы раствора или температуры. Это обусловлено тем, что при отклонении рН от изоэлектрической точки белка, при увеличении ионной силы раствора или при нагревании происходит изменение третичной структуры белковой глобулы и обнажение ее гидрофобных участков. Увеличение гидрофобности приводит к более прочному связывания белка с твердой фазой. Его меньше десорбируется на последующих стадиях инкубации и промывок и, тем самым, увеличивается чувствительность анализа [15, 28]. Однако, денатурационные изменения должны быть таковы, чтобы еще сохранялась способность к специфическому взаимодействию. В некоторых случаях имеет значение также состав буферного раствора. Так, адсорбция липидных антигенов на полистироле увеличивается в присутствии дезоксихолата натрия[31], а при инкубации липополисахаридов требуется наличие до 10 - 20 мМ МgCl2 [29].

Другим важным моментом для стадии получения иммуносорбента, кроме величины сорбционной емкости, является время достижения равновесия: специфический реагент твердая фаза. Оно зависит от концентрации специфического реагента. Увеличение концентрации приводит, как уже указывалось, к многослойной сорбции, поэтому используют оптимальную величину, найденную в предварительных опытах. С увеличением температуры время достижения равновесия за счет увеличения коэффициента диффузии белка уменьшается. Однако значительное повышение температуры недопустимо из-за возможной инактивации специфического реагента. Обычно рекомендуемый интервал температур 4 - 40 °С, при этом равновесие достигается через 30 - 120 минут. Уменьшение этого времени может быть достигнуто за счет использования различных встряхивателей.

С температурным влиянием связан, так называемый, краевой эффект, заключающийся в большей величине ферментативной активности краевых лунок планшета после проведения анализа по сравнению с внутренними [33].

Природа этого эффекта может быть обусловлена либо различиями в поверхностных характеристиках этих лунок [11], либо различиями в температурных режимах [17]. Критический анализ, проведенный в работе [57], однозначно показал, что причина эффекта заключается в существовании температурного градиента между краевыми и внутренними лунками. Особенно отчетливо это проявляется при 30 минутной инкубации, когда температура повышается от 20 °С до 37 °С.

Важным практическим моментом при получении иммуносорбента кроме величины сорбционной емкости и времени достижения ее максимума является степень чистоты специфического реагента. В инкубационном растворе не должны присутствовать посторонние белки или детергенты, которые являются активными конкурентами за места связывания на твердой фазе. Так 100-кратный избыток неспецифического белка или детергента полностью подавляет адсорбцию специфического антигена [32].

Для пористых мембран это условие не является обязательным, т.к. они обладают большой сорбционной емкостью. Допустимая концентрация детергента составляет в этом случае 0,1 % [47].

Назад

ФБУН НИИ эпидемиологии
и микробиологии имени Пастера
Отдел новых технологий