Методы ковалентного связывания

Основные недостатки методов физической сорбции, такие как десорбция на последующих стадиях анализа, малая величина сорбционной емкости для некоторых белков, олиго-пептидов и гаптенов могут быть устранены за счет ковалентного присоединения специфического реагента к твердой фазе.

С этой целью в такие полимеры как полистирол вводят новые реакционные группы типа амино-, гидразидо- или диазо-групп. Твердые фазы из нейлона или капрона подвергают частичному кислотному гидролизу, приводящему к образованию амидных групп. Суспензионные твердые фазы уже содержат реакционноспособные гидроксильные, амидные или карбоксильные группы. Ковалентное присоединение к ним специфического реагента, содержащего амино-группы, может быть осуществлено с помощью таких реагентов, как глутаровый альдегид, бромциан, гидразин, 1.4-ди-эпоксипентан, дивинилсульфон, эпихлоргидрин, гидрохинон, периодат натрия, водорастворимые карбодиимиды, N-гидроксисукцинимид и др.

Сравнение методов физической сорбции и ковалентного связывания показало [38], что десорбция специфического реагента составила 30% для полистирола, 60 % для нейлона и только 13 % для бромциан-активированной бумаги. В то же время сорбционная емкость при ковалентном связывании была 5 - 10 раз выше, чем при физической сорбции. Чувствительность же анализа при использовании в качестве твердой фазы бромциан-активированной бумаги только в 2 раза выше, чем при использовании полистирола [38]. Ковалентное присоединение к частично гидролизованному нейлону обеспечивает 30-кратное увеличение сорбционной емкости по сравнению с физической сорбцией на полистироле. Однако, и в этом случае увеличение чувствительности анализа было значительно меньше, чем увеличение количества сорбированного специфического реагента [26]. Это обусловлено, по-видимому, стерической недоступностью многих эпитопов при слишком плотном ковалентном связывании специфического реагента.

Поэтому основными преимуществами ковалентного связывания следует считать более высокую воспроизводимость результатов и возможность многократного использования иммбилизованной твердой фазы. Первое обусловлено устранением различий в характере поверхности разных лунок, шариков или пробирок, а также прекращением неконтролируемой десорбции на последующих этапах анализа. Второе преимущество связано с возможностью разрыва связи между иммуносорбентом и последующими специфическими реагентами за счет понижения рН или увеличения концентрации хаотропных ионов при условии, что это не приводит к потере специфической активности иммуносорбента.

Назад

ФБУН НИИ эпидемиологии
и микробиологии имени Пастера
Отдел новых технологий