Методы периодатного окисления

Пероксидаза содержит 6 лизиновых остатков из, примерно, 300 аминокислот, но только 1 или 2 из них стерически доступны (связывают 1-фтор-2,4-динитробензол). Недостаток активных NН2-групп может быть устранен путем окисления углеводных остатков до альдегидных групп, т.к. пероксидаза содержит 8 углеводных цепей, составляющих 21 % от молекулярной массы фермента [67]. Альдегидные группы вступают в реакцию с амино-группами белков с образованием основания Шиффа. Для того, чтобы не происходило полимеризации окисленной пероксидазы, ее амино-группы предварительно блокируют либо с помощью 1-фтор-2,4-динитробензола [46], либо с помощью протона [68]. Тем не менее, оба эти способа не обеспечивают полной блокировки амино-групп и степень полимеризации пероксидазы составляет 35 % и 5 % соответственно. За счет уменьшения избытка окислителя можно подобрать условия, не требующие блокировки амино-групп [64].

Для каждой стадии проведения этих методов важно соблюдение таких условий как рН, температура, время и молярное соотношение реагентов.

Так взаимодействие 1-фтор-2,4-динитробензола с амино-группами пероксидазы происходит при рН 9 - 10. Блокировку же протоном проводят при рН 4 - 5. Понижение рН ниже 4 приводит к инактивации фермента.

На стадии окисления важным моментом является молярное отношение пероксидаза : периодат натрия. Это обусловлено следующими факторами. Во-первых, при значительном избытке окислителя или длительном времени окисления может произойти дальнейшее превращение альдегидных групп до карбонильных, т.к. они более легко окисляются, чем группы углеводного кольца. Во-вторых, при увеличении концентрации периодата натрия происходит постепенная инактивация пероксидазы вследствии окисления некоторых аминокислотных остатков типа метионина и нарушения, тем самым, третичной структуры фермента [25]. В-третьих избыточное окисление увеличивает процесс полимеризации.

Для стадии взаимодействия окисленной пероксидазы со специфическим реагентом также важно их молярное соотношение и время реакции. Обычно рекомендуемый двойной весовой избыток IgG, как специфического реагента, позволяет получать наибольший выход фракции конъюгата, в которой на одну молекулу IgG приходится 1 - 2 молекулы фермента. Значительное отклонение от этого соотношения в сторону большего числа молекул специфического реагента приводит к уменьшению ферментативной активности конъюгата, а увеличение числа молекул фермента снижает его иммунохимическую активность.

После стадии образования основания Шиффа необходимо восстановление иминовой связи, чувствительной к гидролизу в щелочной среде, с помощью боргидрата натрия. Кроме того, это необходимо для восстановления непрореагировавших альдегидных групп пероксидазы и уменьшения, тем самым, степени полимеризации конъюгата.

Периодатные способы получения конъюгатов кроме пероксидазы могут быть сипользованы и для других гликопротеиновых ферментов, таких как амилгликозидаза [17], глюкозидаза [36] и др.

Назад

ФБУН НИИ эпидемиологии
и микробиологии имени Пастера
Отдел новых технологий