Очистка конъюгатов

Во всех перечисленных методах реакционная смесь наряду с конъюгатами различной молекулярной массы содержит непрореагировавшие исходные компоненты, а в некоторых случаях и их полимеры. Для выделения из конъюгата наиболее активной фракции обычно используют гель-хроматографию на сефадексе G-200, ультрагеле АсА-44, сефакриле S-300 и др.

Для пероксидазных конъюгатов устранение избытка свободного фермента осуществляют с помощью высаливания 50 % сульфатом аммония или аффинной хроматографией на белок А-сефарозе [10]. Удаление свободных IgG может быть осуществлено аффинной хроматографией на конканавалин А-сефарозе [10]. При этом необходимо помнить, что пероксидаза, окисленная периодатом натрия, не взаимодействует с конканавалином А, следовательно этот способ очистки нельзя применять для периодатных конъюгатов. Кроме того, небольшое количество IgG (около 5 %) взаимодействует с конканавалином А [6], поэтому перед конъюгированием IgG следует пропустить через колонку с конканавалином А.

Необходимость проведения стадии очистки конъюгата во многом зависит от способа его получения. Обязательно следует чистить конъюгаты, полученные с помощью гомобифункциональных сшивающих реагентов, т.к. их выходы очень низки. Как правило подвергают очистке конъюгаты, полученные с помощью других методов, хотя в них степень гомогенности и выход целевого продукта значительно выше. Пероксидазные конъюгаты, полученные периодатным методом, по нашим данным, можно использовать без очистки. Это обусловлено тем, что вступают в реакцию до 70 % пероксидазы и более 90 % IgG . Свободная пероксидаза не приводит к значительному увеличению фонового сигнала при использовании такого промывного раствора, как натрий-фосфатный буфер, рН 7,2 - 7,4, содержащий 0,65М NaCl и 0,05 % твина-20.

Назад

ФБУН НИИ эпидемиологии
и микробиологии имени Пастера
Отдел новых технологий