Основные понятия ферментативной кинетики

Ферментативное превращение субстрата (С) в продукт (П) происходит через образование промежуточного комплекса (Ф-С)

Зависимость начальной скорости реакции (Vо) от экспериментальных параметров дает уравнение Михаэлиса - Ментен

где Vмакс - максимальная скорость реакции, достигаемая при условии, что все количество фермента связано в комплексе с субстратом; |С| - концентрация субстрата; Км - константа Михаэлиса - Ментен, представляющая собой комбинацию констант скоростей образования комплекса |k1| и разрушения |k1 и k2|. При этом Км равна:

Другой величиной оценки фермента являются единицы ферментативной активности (Е). Е - это такое количество фермента, которое катализирует превращение субстрата 1мкмбль/мин. Удельная активность равна ферментативной активности, отнесенной к 1 мг фермента. Физический смысл Км заключается в следующем: при 50 % насыщении субстратом активных центров фермента Vо = 0,5Vмакс, тогда уравнение (6-2) примет вид:

Таким образом, Км равна такой концентрации субстрата, которая необходима для связывания половины активных центров фермента.

Наряду с одноферментными реакциями могут быть использованы циклические ферментные реакции. Этот подход, разработанный для щелочной фосфатазы и получивший название "каскадного" усиления [60], позволяет обнаруживать 10-17 М фермента [30].

Принцип метода заключается в том, что конъюгат со щелочной фосфатазой катализирует дефосфорилирование NАДР+ в NАД. Затем добавляют усиливающий раствор, в котором содержится два фермента. Один из них - алкогольдегидрогеназа-превращает этанол в ацетальдегид, при этом NАД выступает в роли кофактора и превращается в NАДН. Другой фермент-диафораза-превращает производное тетразолия в окрашенный формазан, при этом NАДН регенерируется в NАД.

Назад

ФБУН НИИ эпидемиологии
и микробиологии имени Пастера
Отдел новых технологий