Методы выражения концентрации антител

Количественное измерение концентрации антител в твердофазном ИФА невозможно. Это связано с тем, что количество антител в специфическом комплексе зависит не только от концентрации антител в исследуемой пробе, но и от их аффинности, при этом имеет место конкуренция между низко- и высокоаффинными антителами за антигенные детерминанты иммуносорбента. Поэтому положение и наклон доза-ответной кривой будет отличаться как для сывороток, содержащих разное соотношение иммуноглобулинов различных классов, так и для сывороток с одинаковым соотношением иммуноглобулинов, но с различной аффинностью. Кроме того, концентрация антител в исходных сыворотках может меняться в широком интервале, достигающем 6 lg. Это приводит к тому, что вместо абсолютной концентрации антител проводят оценку их антительной активности.

Положительно - отрицательный метод

Сущность этого метода заключается в том, что рассчитывают средние значения величин сигналов от 100 - 120 заведомо отрицательных, по данным клиницистов, сывороток и вычисляют величину стандартного отклонения. Тогда превышение величины сигнала для исследуемой сыворотки, взятой в том же измерении, на 2 - 3 СО по сравнению со средним значением сигнала отрицательного пула позволяет считать эту сыворотку положительной ( + ). Процент положительных сывороток называется выявляемостью и не имеет отношения к чувствительности анализа.

Метод титрования (Т)

В этом методе измеряют сигналы серийных разведений каждой сыворотки. Разведение, при котором сигнал равен сигналу контроля плюс 2 - 3 СО, называется титром (Т).

Метод эффективной дозы (ЭД)

Этот метод является разновидностью метода титрования. После титрования референсной и исследуемых сывороток продолжают линейные участки кривых до пересечения с осью абсцисс и рассчитывают разность в IgТ.

Метод зоны

Принцип метода заключается в вычислении площади между кривыми титрования парных сывороток. Критерием положительной зоны, свидетельствующей о нарастании специфических антител, является превышение вычисляемой площади над определенным числом. Это число рассчитывается как средняя зона доза-ответных кривых, получаемых из многократного анализа низкоположительных и высокоположительных сывороток плюс удвоенные средние квадратичные отклонения от ширины кривых, а также площадь зоны, измеренной для парных сывороток с достоверным нарастанием титров антител в 4 и более раз по данным серологических методов.

Метод величины сигнала (ВС)

Метод заключается в измерении величины сигнала для одного и того же разведения исследуемых сывороток и референсного пула. По ВС больные могут быть разбиты на группы с различными особенностями протекания инфекционного процесса.

Метод отношения (П/О)

В этом методе рассчитывают отношение ВС исследуемых и пула отрицательных сывороток, взятых в одинаковом разведении. При П/О больше, чем 2 - 3,сыворотку считают положительной.

Метод многократной нормальной активности (МНА)

Он представляет собой попытку улучшить корреляцию получаемых результатов с титром, используя, тем не менее, одно разведение используемой сыворотки. После титрования положительного референсного пула сывороток строится доза-ответная кривая и ее завершающая часть аппроксимируется параболой. Для мест пересечения параболы с сигмо-идной кривой (точки А и В) рассчитывают значение величин сигнала и lg Ti. На основании этих величин рассчитывается константа (я) сигмо-идной кривой по формуле:

где lgTB, lgTA - логарифмы разведения положительного референсного пула в точках А и В, lgBCB, lgBCA - логарифмы интенсивностей сигналов в этих же точках.

Затем измеряют величины сигналов для исследуемых сывороток (Bd) и положительного референсного пула (BCn), взятых в одинаковом разведении, которое лежит в интервале lgTB - lgTА. Величина МНА для каждой исследуемой сыворотки рассчитывается по формуле:

Метод стандартной кривой (СК)

Сущность метода заключается в том, что для большого набора сывороток (от отрицательных до сильноположительных) получают доза-ответные кривые. На основании полученных кривых строится "средняя" кривая. Тогда, зная значения величин сигнала для исследуемых сывороток при одинаковом разведении, можно рассчитать по "средней" кривой величины их титров.

Сравнительный анализ некоторых из перечисленных методов с методом титрования показал, что только методы эффективной дозы стандартной кривой позволяют получить результаты, пропорциональные титру. Удовлетворительные результаты дает также метод многократной нормальной активности. Результаты остальных методов слабо коррелируют с титром исследуемых сывороток (табл.4).

Таблица 4. Методы оценки активности антител в ИФА.

Назад

ФБУН НИИ эпидемиологии
и микробиологии имени Пастера
Отдел новых технологий