Компоненты ИФА

Антигены, используемые в ИФА

В ИФА в качестве иммуносорбента используются, как уже говорилось выше, антигены. Одним из важных моментов при создании диагностического теста является определение его антигенной композиции. При этом, в зависимости от цели диагностики состав антигенов может быть различным.

Известно, что для полноценной и эффективной детекции антител при диагностике инфекционного заболевания, необходимо максимально имитировать антигенный состав нативного возбудителя.

Использование смеси, состоящей из нескольких белковых молекул, для сорбции иммунологических планшетов может приводить к определенным проблемам как биотехнологического, так и экономического характера (усложнение и, следовательно, удорожание процесса производства). Белки могут конкурировать за сорбционную поверхность, а также может происходить взаимодействие белков в реакционной смеси, что может приводить к экранированию части эпитопов. Кроме того, белковые молекулы могут требовать различных условий сорбции, обеспечивающих каждому антигену наиболее полную экспрессию всех эпитопов. Современные методы позволяют конструировать искусственные рекомбинантные молекулы, объединяющие различные антигенные эпитопы, локализованные в разных белках инфекционного агента и даже принадлежащие его разным штаммам. Компьютерный анализ позволяют оценивать пространственную структуру нативных вирусных белков и точно воспроизводить ее при дизайне искусственных молекул антигенов.

Применяемые в ИФА антигены делятся на две группы:

  • синтетические;
  • рекомбинантные.

Получение рекомбинантных белков

Технология рекомбинантных ДНК (генная инженерия) - это совокупность экспериментальных процедур, позволяющая осуществлять перенос генетического материала (ДНК) из одного организма в другой. Чаще всего эксперименты проводят по следующей схеме.

Из организма-донора нужных генов - экстрагируют нативную ДНК либо синтезируют химически. Соединяют ее с другой ДНК - вектор для клонирования - с образованием новой рекомбинантной молекулы. Эту конструкцию вводят в клетку-хозяина, где она реплицируется и передается потомкам. Этот процесс называется трансформацией. Идентифицируют и отбирают клетки, несущие рекомбинантную ДНК. Получают специфический белковый продукт, синтезированный клетками-хозяевами, что служит подтверждением клонирования искомого гена.

Бактерия Escherichia coli - один из наиболее хорошо изученных организмов. За последние пятьдесят лет удалось получить исчерпывающую информацию о генетике этого микроорганизма, молекулярной биологии, биохимии, физиологии и общей биологии. Это грамотрицательная непатогенная подвижная палочка длиной менее 1 мкм. Ее средой обитания является кишечник человека, но она также может высеваться из почвы и воды. Благодаря способности размножаться простым делением на средах, содержащих только ионы Na+, K+, Mg2+, Са2+, NH4+, Cl-, НРО42- и SO42-, микроэлементы и источник углерода (например, глюкозу), Е.coli стала излюбленным объектом научных исследований.

Е.coli можно культивировать как в аэробных (в присутствии кислорода), так и в анаэробных (без кислорода) условиях. Однако для оптимальной продукции рекомбинантных белков Е.coli и другие микроорганизмы обычно выращивают в аэробных условиях. Если целью культивирования бактерий в лаборатории является синтез и выделение определенного белка, то культуры выращивают на сложных жидких питательных средах в колбах. Для обеспечения условий, оптимальных для максимальной продукции белков, конструируют специальные ферментеры и создают системы аэрации.

Плазмиды - это внехромосомные автономно реплицирующиеся двухцепочечные кольцевые молекулы ДНК. Плазмиды есть практически у всех бактерий. Одни из них содержат информацию, обеспечивающую их собственный перенос из одной клетки в другую (F-плазмиды), другие несут гены устойчивости к антибиотикам (R-плазмиды) или специфические наборы генов, ответственных за утилизацию необычных метаболитов (плазмиды деградации). Есть плазмиды, в которых не обнаружены гены, выполняющие какие-то определенные функции (криптические плазмиды; от англ, cryptic - скрытый, латентный). Размеры плазмид варьируют от менее 1 до более 500 т.п.н. Каждая из них содержит сайт начала репликации, без которого репликация плазмиды в клетке-хозяине была бы невозможна.

Некоторые плазмиды представлены в клетке 10-100 копиями; они называются высококопийными. Низкокопийные плазмиды присутствуют в клетке в числе 1 - 4 копий. На долю плазмидной ДНК обычно приходится 0,1 - 5,0% суммарной клеточной ДНК [38]. Если две или более плазмиды не могут сосуществовать в одной и той же клетке, то говорят, что они принадлежат к одной группе несовместимости. Плазмиды, относящиеся к разным группам несовместимости, беспрепятственно существуют в одной клетке, независимо от числа копий. У некоторых микроорганизмов в одной клетке было обнаружено до 8 - 10 разных плазмид, при этом каждая из них выполняла свои функции, была представлена характерным для нее числом копий и относилась к своей собственной группе несовместимости. Одни плазмиды несут специфичный сайт инициации репликации и могут реплицироваться только в клетках одного вида. У других плазмид этот сайт менее специфичен, и они реплицируются в самых разных бактериальных клетках. Соответственно различают плазмиды с узким и с широким спектром хозяев.

Как автономно реплицирующиеся генетические элементы плазмиды обладают всеми основными свойствами, которые позволяют использовать их в качестве вектора для переноса клонируемой ДНК. Но довольно часто природные (немодифицированные, несконструированные) плазмиды бывают лишены некоторых обязательных для "высококачественного" вектора свойств. К таким важным свойствам относятся:

  • небольшой размер, поскольку эффективность переноса экзогенной ДНК в Е.coli значительно снижается при длине плазмиды более 15 т. п. н.;
  • наличие уникального сайта рестрикции, в который может быть осуществлена вставка;
  • наличие одного или более селективных генетических маркеров для идентификации реципиентных клеток, несущих рекомбинантную ДНК. Поэтому плазмидные векторы приходится создавать с помощью генной инженерии.

Плазмидный вектор pBR322 в 80-е годы был одним из самых популярных универсальных векторов. Обычно обозначение плазмидного вектора включает строчную букву р (от англ, plasmid) и еще несколько букв, имеющих отношение к описанию вектора или к истории его создания. Так, буквы BR в обозначении плазмиды pBR322 указывают на авторство Ф. Боливара и Р. Родригеса, сконструировавших эту плазмиду, а число 322 - цифровое обозначение, взятое из их исследовательских протоколов. Длина плазмиды pBR322 - 41 п. н. Она несет два гена устойчивости к антибиотикам, ампициллину (Аmрг) и тетрациклину (Tetr), а также уникальные сайты для BamHI, Hind III и SalI в генеТеtг, один PstI-сайт в гене Атрг, один сайт для EcoRI, находящийся за пределами кодирующих последовательностей, и сигнал начала репликации, обеспечивающий репликацию исключительно в Е.coli. Плазмида реплицируется с образованием большого числа копий, в другие бактериальные клетки переносится с трудом.

Как работает клонирующий вектор pBR322? Если очищенную кольцевую плазмиду pBR322 обработать рестриктазой, расщепляющей ее в единственном сайте, расположенном в одном из генов устойчивости к тому или другому антибиотику, то образуется линейная молекула с липкими концами. Такие молекулы смешивают с донорной ДНК, содержащей нужный ген и предварительно обработанной такой же рестриктазой. Поскольку липкие концы этих двух ДНК взаимно комплементарны, они спариваются с образованием гибридных молекул. Далее смесь обрабатывают ДНК-лигазой фага Т4 в присутствии АТФ, в результате чего образуется множество разных комбинаций фрагментов, а также нежелательные продукты, в частности объединившиеся между собой фрагменты донорной ДНК и исходные плазмидные ДНК. Чтобы уменьшить количество последних, обрабатывают рестрицированную плазмидную ДНК щелочной фосфатазой, отщепляющей от линеаризованной молекулы 5'-фосфатные группы: ДНК-лигаза не может сшить концы дефосфорилированной линейной плазмидной ДНК. Что касается собственно рекомбинантных молекул ДНК, то хотя в них и имеются два одноцепочечных разрыва, ее фрагменты удерживаются вместе двумя фосфодиэфирными связями, образовавшимися с помощью ДНК-лигазы между дефосфорилированной плазмидной ДНК и рестрицированной донорной ДНК. После репликации в трансформированной клетке одноцепочечные разрывы устраняются системой лигирования клетки-хозяина.

Ввод рекомбинантной ДНК в клетку-хозяина называется трансформацией. Для ее осуществления используют специально разработанные приемы, например подвергают клетки высокотемпературному воздействию и обрабатывают их хлористым кальцием (СаС12). Однако эффективность трансформации все же остается невысокой, обычно трансформируется не более одной клетки из тысячи. Таким образом, большинство клеток после проведения трансформации не содержат рекомбинантной ДНК. В некоторых из них появляется воссоединившаяся кольцевая плазмидная ДНК, избежавшая дефосфорилирования щелочной фосфатазой, в других - неплазмидная ДНК и лишь в некоторых - плазмида со встроенным фрагментом чужеродной ДНК (гибридная плазмида) [37].

Внехромосомная ДНК, не содержащая точки начала репликации, не может реплицироваться в бактериальной клетке. Таким образом, проникновение в клетку экзогенной ДНК еще не означает, что она будет поддерживаться в хозяйской клетке. Далее, для сохранения рекомбинантной ДНК в клетке-хозяина в первоначальном виде, необходимо, чтобы в клетке отсутствовали гены, кодирующие синтез рестриктаз, которые могут привести к ее деградации, и чтобы клетка имела фенотип RecA- (такие клетки неспособны к общей рекомбинации, так что экзогенная ДНК не будет модифицироваться в результате гомологичной рекомбинации). Затем необходимо идентифицировать клетки, содержащие рекомбинантную ДНК. Способ идентификации должен быть как можно более простым, поскольку приходится проверять огромное число клеток. В системе pBR322, в которой чужеродная ДНК встраивается в сайт BamHI, специфическая идентификация состоит из двух этапов. Сначала клетки после трансформации высевают на питательную среду, содержащую ампициллин. В таких условиях могут вырасти только те клетки, в которых присутствует интактный ген Ampг - или в составе интактной плазмиды pBR322, или в составе гибридной плазмиды; нетрансформированные клетки чувствительны к ампициллину. Сайт BamHI расположен в гене Tetr плазмиды pBR322, встраивание в этот ген фрагмента ДНК прерывает кодирующую последовательность, и устойчивость к тетрациклину утрачивается. Таким образом, клетки, несущие гибридную плазмиду, устойчивы к ампициллину, но чувствительны к тетрациклину, а клетки, получившие интактную плазмиду pBR322, несут ген Tetr и устойчивы как к ампициллину, так и к тетрациклину.

На втором этапе проводят разделение этих двух вариантов. Клетки, выросшие на среде с ампициллином, переносят на среду с тетрациклином методом перепечатки. Клетки, образующие колонии на чашках с тетрациклином, содержат интактную плазмиду pBR322, поскольку они устойчивы и к ампициллину, и к тетрациклину. Клетки, не выросшие на чашках с тетрациклином, чувствительны к этому антибиотику, значит, они содержат гибридную плазмиду pBR322. Среди колоний, выросших на среде с ампициллином, выделяют те, которые оказались чувствительны к тетрациклину, и из каждой колонии получают индивидуальные клеточные клоны или (чаще делают именно так) объединяют все колонии, устойчивые к ампициллину и чувствительные к тетрациклину, и культивируют их вместе. Далее можно провести дополнительный скрининг и идентифицировать те клетки, которые несут гибридную плазмиду pBR322 со специфической вставкой. Присутствие сайтов Hind III и Sal I в гене Tetr и сайта Pst I в гене Ampг плазмиды pBR322 позволяет изменить локализацию клонированных фрагментов чужеродной ДНК. Если для встраивания используется сайт Pst I, то отбор проводится по той же схеме, но в другом порядке, т. е. сначала высевают клетки на среду с тетрациклином, а затем - с ампициллином.

Ферментный коньюгат

Последним компонентом специфического комплекса на твердой фазе является коньюгат. Коньюгат - вещество (антивидовые антитела), содержащее ферментную метку и способное специфически связываться с антителом. Образующиеся иммунные комплексы антиген-антитело выявляют с помощью коньюгата пероксидазы хрена с моноклональными антителами.

Для высокочувствительных методов ИФА необходимы конъюгаты белок - фермент, в которых белок сохраняет иммунологическую активность и не происходит инактивация фермента. Таким требованиям наилучшим образом отвечает конъюгат белок - фермент состава 1:1. При увеличении числа молекул фермента существенно уменьшается иммунологическая активность белка, так как при этом возрастают стерические препятствия для протекания иммунной реакции и увеличивается вероятность того, что фермент окажется связанным с активным центром антитела или антигенной детерминантой антигена. При уменьшении числа молекул фермента, связанных с белком, значительно понижается ферментативная активность по сравнению с ростом неспецифических взаимодействий конъюгата. Из реакционной смеси конъюгаты выделяют диализом или путем гельфильтрации, а для очистки иногда применяют аффинную хроматографию.

Методы получения конъюгатов, т.е. комплексов фермента со специфическим реагентом, разделяют на химические и иммунохимические. Принцип методов третьей группы заключается в последовательном проведении двух этапов. На первом этапе, с одной стороны, фермент, а с другой стороны, специфический реагент химически модифицируются реагентами, имеющими между собой высокое значение константы связывания, например, авидин-биотин или гаптен-антитело. На втором этапе проводят реакцию между модифицированным ферментом, приводящую к образованию конъюгата по типу антиген-антитело.

Фермент реагирует с вводимым на последний стадии анализа субстратом. Ферментная активность коньюгата, а, следовательно, и концентрация будет пропорциональна концентрации остальных компонентов комплекса, один из которых подлежит определению. За счет сопряженной ферментативной реакции обуславливается высокая чувствительность ИФА (до 10 - 21молей). Применение ферментной метки позволяет создавать каскадные системы усиления слабых химических сигналов.

Существует достаточно большое число ферментов, используемых в ИФА. В ИФА туберкулеза в качестве фермента чаще применяется пероксидаза хрена. А субстратом для этого фермента является тетраметилбензидин (ТМБ).

Моноклональные антитела

Моноклональные антитела, использующиеся в тест - системах иммунофементного анализа, позволяет существенно повысить специфичность этого метода, поскольку они связываются с одним, строго определенным антигенным сайтом.

Для практического применения антител в качестве диагностического инструмента или компонентов терапевтических средств необходимо было создать такую линию клеток, которая росла бы в культуре и продуцировала антитела одного типа, обладающие высоким сродством к специфическому антигену-мишени, - моноклональные антитела. Подобная клеточная линия могла бы стать неиссякающим источником идентичных молекул антител. К сожалению, В-лимфоциты (В-клетки), синтезирующие антитела, не могут воспроизводиться в культуре. Решение данной проблемы виделось в создании гибридной клетки. Получив генетическую составляющую от В-клетки, она могла бы вырабатывать антитела, а, приобретя способность к делению от клетки совместимого типа - расти в культуре. Было известно, что В-лимфоциты иногда перерождаются и становятся раковыми (миеломными) клетками, приобретая способность к росту в культуре и сохраняя в то же время многие свойства В-клеток. Так клетки миеломы, в первую очередь те, которые не вырабатывают антител, стали кандидатами на слияние с антителопродуцирующими В-клетками. В середине 70-х гг. эти идеи стали реальностью.

Моноклональные антитела синтезируются отдельными клонами гибридных клеток (гибридомами), которые впервые были получены в 1975 г. Келером и Мильштейном в результате соматической гибридизации клеток миеломных опухолей и В-лимфоцитов, продуцирующих антитела после иммунизации животных соответствующим антигеном.

Первый шаг в процессе получения гибридной клеточной линии, продуцирующей антитела одного типа, состоит во введении мышам антигена. После ряда иммунизаций, проведенных в течение нескольких недель, проверяют, произошло ли развитие у животных иммунного ответа. Если ответ развился, то животных умерщвляют, извлекают селезенку, промывают ее, измельчают и несильно встряхивают для высвобождения единичных клеток, среди которых находятся и антителопродуцирующие В-клетки. Взвесь клеток селезенки смешивают со взвесью миеломных клеток. Особенностью используемых для гибридизации клеток миелом является отсутствие у них фермента гипоксантинфосфорибозилтрансферазы, участвующего в синтезе ДНК. Этот фермент обеспечивает запасной путь синтеза аденозинмонофосфата в тех случаях, когда нормальная цепь ферментативных реакций заблокирована (например, в присутствии ингибитора - аминоптерина). На питательной среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин (ГАТ-среда), такие миеломные клетки размножаться не способны. Комбинированную взвесь в течение нескольких минут инкубируют в 35%-ном полиэтиленгликоле, а затем переносят в среду, содержащую гипоксантин, аминоптерин и тимидин (среда ГАТ). Обработка полиэтиленгликолем облегчает слияние клеток, тем не менее слияние происходит редко и является в достаточной степени случайным событием. В смеси присутствуют клетки миеломы, селезенки, а также слившиеся клетки миеломы-селезенки, миеломы-миеломы, селезенки-селезенки. Однако в среде ГАТ растут только гибридные клетки миеломы-селезенки, все остальные типы клеток не могут в ней пролиферировать. Клетки селезенки и слившиеся клетки селезенки-селезенки вообще не растут в культуре, а миеломные клетки и слившиеся клетки миеломы-миеломы не могут использовать гипоксантин в качестве предшественника в процессе биосинтеза пуриновых оснований гуанина и аденина, без которых невозможен синтез нуклеиновых кислот. Но у них есть другой естественный путь синтеза пуринов - при участии дигидрофолатредуктазы, поэтому в состав среды и входит аминоптерин, ингибирующий активность этого фермента. Таким образом, миеломные клетки и слипшиеся клетки миеломы-миеломы не могут синтезировать пурины в среде ГАТ и погибают.

Слившиеся клетки селезенки-миеломы растут в среде ГАТ, поскольку:

  • клетки селезенки поставляют функциональную гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазу, которая может утилизировать экзогенный гипоксантин среды несмотря на блокирование синтеза пуринов с участием дигидрофолатредуктазы аминоптерином;
  • клетки миеломы способны активно делиться. Тимидин необходим для устранения блокирования в синтезе пиримидинов, обусловленного ингибированием дигидрофолатредуктазы. На 10 - 14-е сутки после слияния клеток в среде ГАТ остаются и растут только слившиеся клетки селезенки-миеломы. Их затем вносят в лунки пластиковых микротитровальпых плашек и выращивают на полной культуральной среде без ГАТ.

Селекция на ГАТ-среде позволяет избавиться от миеломных клеток и играет ключевую роль ввиду очень малого выхода процесса гибридизации (один гибрид на 500 тыс. клеток селезенки).

Не все клетки, растущие на ГАТ-среде, являются гибридомами - продуцентами специфических антител. Это связано с тем, что часть лимфоцитов селезенки синтезирует иммуноглобулины неизвестной исследователю специфичности. Кроме того, на первых этапах роста после слияния гибридомы теряют некоторые хромосомы, а вместе с ними и способность к синтезу специфических антител. Поэтому важным этапом получения гибридом является отбор клеток, стабильно синтезирующих антитела к антигену.

Для этого обычно проводят скрининг культуральных сред, содержащих секретируемые антитела. Тестирование гибридом должно осуществляться на самых ранних стадиях после слияния и предполагает использование таких высокочувствительных методов, как иммуноферментный анализ. Среду из тех лунок, в которых есть растущие клетки, отбирают и переносят в лунки другой микротитровальной плашки, предварительно покрытые слоем молекул антигена-мишени. Если в культуральной среде находится антитело (первое антитело), распознающее один из эпитопов данного антигена, то оно свяжется с антигеном и останется в лунках после их промывания. Затем в лунки добавляют второе антитело, специфичное к мышиным антителам. Оно будет присоединяться к любому первому антителу, связанному с антигеном. К используемому в иммунном анализе второму антителу предварительно присоединяют фермент, который превращает неокрашенный субстрат в окрашенное соединение. Изменение цвета содержимого одной из лунок говорит о том, что исходная культуральная среда содержала антитело, специфичное к данному антигену. Если же такое антитело в среде отсутствовало, то второму антителу не с чем будет связываться и оно вымоется при втором промывании. Субстрат в таких лунках останется неокрашенным.

Однако выявленные на этой стадии антитела не обязательно являются моноклональными. Это обусловлено тем, что в ячейке, где культивируют клетки, может оказаться две и более гибридом, каждая из которых синтезирует свой тип антител. Поэтому следующим шагом после селекции является клонирование гибридом, целью которого является разделение клеток и наращивание отдельных клонов из одной клетки. Для этого клеточную суспензию разводят культуральной средой и высевают в другие лунки. После культивирования полученных клонов среды вновь тестируют, определяя, какая из клеточных линий (гибридом) продуцирует моноклональные антитела, распознающие антиген-мишень. В том случае, когда получают более одной специфичной гибридомы, проводят дальнейшие исследования, позволяющие определить, направлены ли антитела, вырабатываемые разными клонами, против одной и той же антигенной детерминанты. Каждый клон, продуцирующий моноклональное антитело, можно поддерживать в культуре практически бесконечно. Кроме того, образцы можно заморозить в жидком азоте и использовать их в дальнейшем как источник клеток.

Моноклональные антитела получают, выращивая гибридомы на культуральной среде, или из асцитной жидкости. Гибридомы, выращиваемые в сосудах для культивирования, синтезируют 5 - 10 мкг антител на 1 мл среды. При использовании специальных микроносителей типа "Биосилон", выпускаемых фирмой "Нунк", количество антител увеличивается до 100 мкг/мл.

Важнейшим свойством гибридом, унаследованным от миеломных клеток, представляется их способность давать асцитные опухоли при введении мышам и синтезировать при этом до 15мг антител из 1 мл асцитной жидкости.

Химическая модификация молекулы антитела при получении конъюгатов в некоторых случаях может приводить к уменьшению констант связывания в 10 раз и более. Это послужило стимулом для получения гибридных моноклональных антител, содержащих два различных антиген связывающих центра, один из которых направлен к определенному антигену, а другой - к ферменту, используемому в качестве метки.

Первой стадией при создании гибридных моноклональных антител является получение обычной гибридомы, синтезирующей моноклональные антитела желаемой специфичности к одному из двух антигенов. Затем гибридому адаптируют к росту в присутствии 8-азогуанина и отбирают те клетки, которые способны размножаться на ГАТ-среде. Эти первичные гибридомы, выступающие в роли миеломного партнера, подвергают слиянию с иммунными лимфоцитами мышей, иммунизированных вторым антигеном. В результате слияния и отбора получают дочерние (вторичные) гибридомы, способные синтезировать антитела двойной специфичности. Таким способом были получены гибридные моноклональные антитела, которые одновременно связывались с пероксидазой хрена и поверхностным антигеном. Гибридные антитела оказались стабильными в процессе хранения, не изменяли своей двойственной специфичности и обладали достаточно высокими константами связывания по отношению к обоим антигенам.

Назад

ФБУН НИИ эпидемиологии
и микробиологии имени Пастера
Отдел новых технологий