Описание метода

Использование МИФ для прямого обнаружения вирусных антигенов в материалах от больных.

Приготовление препаратов для иммунофлуоресцентной микроскопии

В качестве материала для исследования служат препараты, содержащие цилиндрический эпителий слизистой оболочки носовой полости, в которых в первые три дня заболевания регулярно обнаруживается присутствие вируса, послужившего причиной респираторного заболевания. На более поздних сроках вирус элиминирует из клеток в секреты дыхательных путей, что снижает результативность МИФ диагностики.

Получение клинических материалов

Важнейшим этапам исследования является получение полноценного материала, в котором содержалось бы достаточно много эпителиальных клеток, которые выстилают глубокие отделы нижних носовых ходов и служат местом репликации вирусов. Эти клетки имеют цилиндрическую, бокаловидную или округлую форму, иногда снабжены ресничками. Они должны иметь четкую структуру с ядром и окружающей его сравнительно небольшой по размеру цитоплазмой.

Необходимо отметить, что ближайшие ко входу отделы носовой полости выстланы плоским или переходным эпителием полигональной формы с мелким ядром и обширной цитоплазмой. Респираторные вирусы не размножаются в этих клетках. Вот почему при получении мазков необходимо вводить тампоны глубоко в нижние носовые ходы.

Процедура взятия мазков сводится к следующему. Если материал берется у маленьких детей, во избежание повреждения слизистой при резких движениях ребенка нужна помощь ассистента, который усаживает его к себе на колени, одной рукой прижимает руки ребенка, а другой рукой - голову. Детей старше 7 лет и взрослых больных усаживают в положение с приподнятым носом. При обильном слизистом или слизисто-серозном отделяемом необходимо очистить полость носа сухим ватным тампоном. При обильных гнойных выделениях проводят наиболее тщательную очистку носовых ходов, без чего материал для исследования забирать не следует, поскольку обилие детрита и неспецифически светящихся лейкоцитов не позволит провести ИФ анализ. Сухой тонкий тампон вводят в нижний носовой ход как можно глубже (взрослым и школьникам - на глубину до 3 см, детям более младшего возраста - на 1,5 - 2 см). Вращательным движением с небольшим прижатием тампона к стенкам носа снимают со слизистой эпителиальные клетки. Процедуру повторяют другим ватным тампоном со вторым носовым ходом.

При конъюнктивитах и кератоконьюнктивитах вирусной природы материалом для исследования служат мазки-соскобы с конъюнктивы, которые обрабатывают так же, как и мазки из носа, и исследуют клетки на присутствие аденовирусных и герпетических антигенов.

Транспортировка и хранение клинических материалов

Тампоны со снятыми клетками немедленно погружают в пробирку с 2 мл 0.01 М ФСБ. Клинические материалы как можно быстрее (не более чем за 2 часа) доставляют в лабораторию в охлажденном состоянии (замораживание должно быть исключено).

Хранить пробирки с материалом более 2 ч. не рекомендуется, так как при этом происходит разрушение эпителиальных клеток и выход вируса в среду, что снижает результативность анализа. При необходимости приостановку работы можно сделать только после приготовления фиксированных мазков. Всю работу с инфекционным материалом проводят в ламинарном боксе с соблюдением соответствующих правил биобезопасности.

Приготовление мазков

Для получения клеточной суспензии пробирки с тампонами интенсивно встряхивают, после чего тампоны наполовину извлекают, отжимают пинцетом о стенку пробирки и удаляют. Отработанные тампоны погружают в дезинфицирующий раствор. Полученную клеточную суспензию центрифугируют в течение 10 мин. при 1000 об/мин. (не более 500 g - во избежание травматизации клеток), после чего надосадочную жидкость удаляют. Осадок клеток ресуспендируют пипеткой в 0.2 мл ФСБ. Из суспензии клеток на обезжиренных спиртом предметных стеклах готовят мазки. Число мазков (обычно 10 - 12) должно соответствовать количеству тестируемых антигенов. На каждое стекло наносят капли (по 20 мкл) полученной суспензии, располагая их в два ряда в шахматном порядке. Капля не должны растекаться или сливаться, для чего используют предметные стекла с углублениями. При их отсутствии на стекле с помощью тонко заточенного победитового сверла или шлифовального приспособления предварительно делают ограничительные кольца диаметром 6 - 7 мм.

Стекла с мазками быстро высушивают (желательно - в ламинарном боксе) и сразу погружают на 10 мин в химически чистый, безводный, заранее охлажденный при 4 град. C, ацетон - для фиксации. Стекла с фиксированными мазками извлекают пинцетом из ацетона, маркируют, после чего подвергают окрашиванию флуоресцирующими антивирусными иммуноглобулинами.

Фиксированные препараты могут храниться до окрашивания в холодильнике при 4 град. C достаточно продолжительное время (до 3 - 4 месяцев).

Исследование клеточных культур, инфицированных материалами от больных

Флуоресцирующие антитела могут быть применены также для детекции вирусных антигенов в клеточных культурах, инфицированных материалами от больных, при одновременном использовании контрольных, не зараженных культур той же партии. В этом случае все процедуры по взятию клинических материалов и заражению клеточных культур выполняют, как описано в Методических рекомендациях "Выделение вирусов гриппа человека и птиц в клеточных культурах и куриных эмбрионах", Санкт-Петербург, 2006. После соответствующей инкубации (48 час.) или появлении признаков ЦПД (более 25% монослоя) клетки из инфицированных и контрольных флаконов снимают с поверхности пенициллиновых флаконов (ПФ) смесью трипсина с версеном и из полученной суспензии готовят мазки для исследования.

Более детально эти процедуры сводятся к следующему.

  • Среду из каждого ПФ с подлежащими исследованию клетками, инфицированными материалами от больных, отсасывают пипеткой, переносят в отдельные пробирки, маркируют каждую из них, после чего вируссодержащую среду замораживают и хранят при температуре от -20 град. C до -70 град. C до завершения всех исследований.
  • Клеточный монослой инфицированных и контрольных клеточных культур трижды ополаскивают по 1 - 2 мл ФСБ.
  • В каждый ПФ добавляют по 100 мкл смеси растворов 0,05% трипсина и 0.53 мМ версена (ЭДТА x 4Na).
  • Осторожно постукивают по ПФ до отторжения клеток.
  • После сползания монослоя в каждый ПФ добавляют по 1 мл ФСБ. Центрифугируют клеточные суспензии при 500 g в течение 10 мин. в конических пробирках.
  • Осадок ресуспендируют в 0,2 мл ФСБ.
  • Клеточную суспензию наносят на обработанные ацетоном стекла (из расчета по 20 мкл каждой в 10 очерченных кружков). На отдельном стекле аналогичным образом готовят препараты из контрольных (не инфицированных) клеток. Мазки высушивают в ламинарном боксе.
  • Препараты фиксируют в охлажденном ацетоне в течение 10 мин. Дают им высохнуть. Полученные слайды могут храниться в течение нескольких месяцев при температуре - 20 град. C.

Приготовление рабочих растворов флуоресцирующих иммуноглобулинов

Сухой флуоресцирующий иммуноглобулин (конъюгат) растворяют в дистиллированной воде в соответствии с указанным на этикетке объемом, при необходимости (наличие посторонних примесей) центрифугируют 15 минут при 2000 об/мин. для удаления осадка. Растворенный конъюгат можно хранить в течение 20 дней при 4 град. C. При необходимости более длительного хранения коньюгат фасуют по 0.1 мл и хранят в замороженном состоянии при температуре не выше - 20 град. C. Повторное замораживание-оттаивание не рекомендуется. Непосредственно перед употреблением конъюгат разводят ФСБ для получения указанного на этикетке рабочего разведения. Конъюгат в рабочем разведении хранят не более 7 дней.

Окраска препаратов флуоресцирующими иммуноглобулинами

Фиксированные препараты помещают во влажную камеру (специальную или чашку Петри с влажной фильтровальной бумагой на дне). На каждый мазок (в заранее определенном порядке) наносят по 1 капле (25 - 50 мкл) флуоресцирующего иммуноглобулина в рабочем разведении. Препараты помещают во влажную камеру в строго горизонтальном положении и инкубируют в течение 30 мин. при 37 град. C или 40 мин. при комнатной температуре (в темном месте). Следят за тем, чтобы не происходило подсыхания препарата, поскольку это ведет к развитию неспецифических реакций. По завершении периода инкубации препараты быстро ополаскивают дистиллированной водой и сразу погружают в ФСБ на 10 минут для промывания при периодическом покачивании емкости. Раствор ФСБ заменяют дважды, после чего препараты ополаскивают дистиллированной водой и высушивают.

Учет и интерпретация результатов

Анализ препаратов проводят с помощью люминесцентного микроскопа МЛ-2 (или иного типа) с использованием иммерсионного объектива (x 90), сине-фиолетовых светофильтров возбуждения (СФ-1-2, СЗС-7-2) и запирающего светофильтра N 2. При этом следует пользоваться только специальным нефлуоресцирующим иммерсионным маслом или его заменителями (диметилфталат).

При люминесцентной микроскопии в мазках выявляются эпителиальные клетки различной морфологии, а также могут присутствовать лейкоциты, клеточный детрит, слизь. Диагностически значимым является обнаружение вирусных антигенов только в клетках цилиндрического эпителия (удлиненные или округлые клетки с относительно крупным базально расположенным ядром), проявляющееся в виде четкой диффузной или гранулярной флуоресценции, локализованной в ядрах или цитоплазме клеток. Свечение в клетках, полученных непосредственно от больных, чаще определяется в цитоплазме, хотя при гриппе и аденовирусной инфекции можно видеть специфическую флуоресценцию и в ядрах клеток. Диагностически доказательным является обнаружение в мазке не менее 3 клеток цилиндрического эпителия с отчетливо видимой зеленой специфической флуоресценцией.

При люминесцентной микроскопии препаратов клеточных культур, зараженных вирусом, наблюдаемая картина может варьировать в зависимости от заражающей дозы, типа вируса и сроков его репродукции. При гриппозной и аденовирусной инфекции антигены могут быть обнаружены в цитоплазме и в ядрах клеток. В этом случае наблюдается локальное свечение в ядерных структурах или флуоресцирует вся клетка, если антиген располагается одновременно в ядре и цитоплазме. При парагриппозной и респираторно-синцитиальной вирусной инфекции антигены обнаруживаются только в цитоплазме клеток. Препараты неинфицированных клеточных культур не должны окрашиваться флуоресцирующими антителами. В них может наблюдаться лишь еле заметная аутофлуоресценция.

Назад

ФБУН НИИ эпидемиологии
и микробиологии имени Пастера
Отдел новых технологий