Количественное определение содержания вируса краснухи в вирусном материале методом ПЦР с детекцией в режиме реального времени

В процессе создания вакцинных препаратов исследователям приходится решать множество проблем. Немаловажная проблема – оценка активности вируса краснухи в процессе культивирования и накопления вирусного материала, то есть постоянный контроль за репродукцией вируса в культуре клеток и сбор вируса в момент его максимального титра. Использование для этих целей традиционных методов–титрование по ЦПД, например, невозможно, так как методы очень длительны, результаты можно получить только через 8 - 10 дней.

Целью данной работы являлась разработка метода количественного определения содержания вируса краснухи в культуральной жидкости по вирусной РНК с помощью ПЦР.

Была проанализирована нуклеотидная последовательность вакцинного штамма вируса краснухи КА-27/3 и подобраны пара праймеров и флуоресцентный зонд для ПЦР с детекцией в режиме реального времени (ПЦР-РВ). В реакции обратной транскрипции с последующей ПЦР была показана специфичность подобранных праймеров и зонда с использованием РНК, выделенной из зараженной вакцинным штаммом культуры клеток. Проведенные тесты (процедура "плавления" и электрофоретический анализ ПЦР-продукта) показали высокую специфичность выявления РНК вируса краснухи. Установлена зависимость значений пороговых циклов от концентрации вируса, что свидетельствует о возможности проводить количественное определение вирусной РНК методом ПЦР-РВ. Для построения калибровочных прямых был использован калибратор – очищенный ПЦР-продукт с известной концентрацией. Амплификацию, расчет пороговых циклов, построение калибровочных прямых, расчет числа копий к ДНК проводили с использованием амплификатора АНК-16 и его программного обеспечения (НИИ аналитического приборостроения РАН, г. Санкт-Петербург).

Таким образом, отработаны подходы для высокоспецифичного и количественного определения РНК вируса краснухи (штамм КА-27/3) в вирусном материале. (Cм. тезисы: Файзулоев Е.Б. с соавт. "Количественное определение содержания вируса краснухи в вирусном материале методом ПЦР с детекцией в режиме реального времени").

Материалы 9-го съезда эпидемиологов. М., 2007, т. 2, с. 174.

Все новости

ФБУН НИИ эпидемиологии
и микробиологии имени Пастера
Отдел новых технологий