Получение и оценка рекомбинантных видоспецифичных белков Mycobacterium tuberculosis для применения в диагностике туберкулеза

Сконструированы 4 рекомбинантные плазмиды на основе векторной плазмиды pGEX-2T, несущие полные гены esxA, esxB, а также полный и укороченный (без нуклеотидной последовательности, кодирующей лидерный пептид) ген mpt64, кодирующие видоспецифичные высокоиммуногенные белки Mycobacterium tuberculosis. Идентичность каждого клонированного гена природному, соответствующего штамму H37Rv, подтверждена секвенированием. Подобраны оптимальные условия для продукции в штамме Escherichia coli BL21 3 рекомбинантных белков – rESAT-6, rCFP10 и rΔMPT64, которые накапливаются в растворимой форме в цитоплазме бактериальной клетки, а также условия для их выделения и очистки.

Впервые показана принципиальная возможность использования рекомбинантных белков в иммуноферментном и гамма-интерфероновом анализе без предварительного отщепления N-концевой аминокислотной компоненты, используемой в качестве белка-носителя, при установленном уровне выявления антител к N-концевой компоненте рекомбинантного белка – глутатионтрансферазе, не более 1,3% среди исследованных сывороток.

На примере rESAT-6 и rCFP10 установлено, что эти рекомбинантные белки способны выявлять положительные сыворотки по антителам IgG, IgA и IgM среди разных групп обследуемых. Наиболее высокий показатель выявляемости иммуноглобулинов определен для IgG-антител и составил 70% (для IgA - 31,4%, IgM - 11,8%). При использовании панели сывороток, полученных от больных туберкулезом и здоровых доноров, показано, что чувствительность ИФА при испытании rESAT-6 и rCFP10 составила 65 - 79%, rΔМРТ64 - 81%, специфичность – соответственно 92 - 98%, 95 - 98% и 76%.

Показано, что чувствительность гамма-ИФН-метода при стимуляции Т-лимфоцитов rESAT-6, rCFP10 и rΔМРТ64 составила соответственно 84 - 100%, 80 - 95% и 60 - 78%, а специфичность – соответственно 86 - 100%, 82 - 100%, 76 - 97%. При сочетанном использовании трех рекомбинантных белков – rESAT-6, rCFP10 и rΔМРТ64 – специфичность составила 96,2%, а чувствительность – 89,1%. Предложена технологическая схема для наработки и очистки рекомбинантных белков rESAT-6, rCFP10 и rΔМРТ64 в растворимой форме из штаммов-продуцентов. (См. диссертацию "Получение и оценка рекомбинантных видоспецифичных белков Mycobacterium tuberculosis для применения в диагностике туберкулеза").

Болдырев А.Н. Автореф. дис. канд. биол. наук. Кольцово, 2009.

Все новости

ФБУН НИИ эпидемиологии
и микробиологии имени Пастера
Отдел новых технологий