Получение и характеристика рекомбинантных фрагментов белка CagA Helicobacter pylori

Выявление циркулирующих антител к Helicobacter pylori рекомендовано в качестве одного из основных приемов первичной диагностики инфекции этим патогеном. Длительное время чувствительность, специфичность и воспроизводимость серологических тестов оставались низкими вследствие того, что источником антигенов служили лизаты клеток H.pylori. Кроме того, использование тотальных белковых препаратов бактерий не позволяло выявить специфические антитела к факторам патогенности H.pylori и, таким образом, оценить вирулентный потенциал патогена.

Цитотоксин CagA признан одним из основных факторов, определяющих патогенность H.pylori, ассоциированную с повышенным риском развития заболеваний гастродуоденальной зоны, в том числе онкологических. Установлено, что CagA является иммунодоминантным белком, и антитела, специфичные к нему, обнаружены у подавляющего большинства носителей инфекции CagA-позитивными штаммами H.pylori. Определение титра антител к цитотоксину в сыворотке крови представляется весьма эффективным методическим приемом, однако проблема получения чистого белка CagA в препаративных количествах из H.pylori остается не решенной. Для ее преодоления целесообразно применение технологии создания рекомбинантных белков. Задача работы состояла в создании рекомбинантных фрагментов белка CagA H.pylori, их очистке и характеристике.

Для реализации поставленных задач использованы методы молекулярного клонирования, экспрессии рекомбинантных белков в Escherichia coli, аффинной хроматографии, гель-электрофореза и вестерн-блота, а также различные алгоритмы анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей.

Получены 4 рекомбинантных фрагмена белка CagA, содержащих N-терминальный гексагистидиновый мотив. Белок rCagAfr.1 (65 кДа) представляет наиболее консервативный N-концевой участок цитотоксина. Фрагмент rCagAfr.2 (44 кДа) соответствует центральному консервативному участку CagA, в то время как rCagAfr.3 (39 кДа) представляет высоко вариабельный С-концевой участок CagА. Наконец, белок rCagAfr.4 (75 кДа) включает в себя последовательности rCagAfr.2 и rCagAfr.3. Анализ последовательностей рекомбинантных фрагментов позволяет предположить, что rCagAfr.2 и rCagAfr.4 являются высоко иммуногенными белками. Хроматографическая очистка рекомбинантных полипептидов позволила достичь высокой степени чистоты (97%) и высокого выхода целевых белков (около 15 мг/л культуры).

Использование технологии рекомбинантных белков позволило преодолеть проблему получения чистого белка CagA H.pylori, что открывает новые возможности для создания иммунодиагностических тест-систем, направленных на выявление белка CagA или антител против цитотоксина. (См. статью: Климович А.В. с соавт. “Получение и характеристика рекомбинантных фрагментов белка CagA Helicobacter pylori”).

"Журн. микробиол.", 2010, № 2, с. 74 - 79.

Все новости

ФБУН НИИ эпидемиологии
и микробиологии имени Пастера
Отдел новых технологий