Метод видоспецифичной идентификации патогенных для человека ортопоксвирусов на основе мультиплексной ПЦР в реальном времени

Группа патогенных для человека ортопоксвирусов принадлежит к роду Orthopoxvirus семейства Poxviridae и включает в себя такие вирусы, как вирус натуральной оспы (VARV), вирус оспы обезьян (MPXV), вирус оспы коров (CPXV) и вирус осповакцины (VACV). Входящие в эту группу виды морфологически тождественны, близки антигенно и иммунологически и в то же время разительно отличаются друг от друга по спектру их патогенности, контагиозности вызываемой инфекции и другим показателям.

Для предупреждения угрозы перехода локальных вспышек ортопоксвирусных инфекций в распространенные эпидемии необходимо иметь быстрые и точные методы видоспецифичной идентификации ортопоксвирусов, патогенных для человека. Существующие морфологические, биологические и серологические методы не подходят для целей быстрой видоспецифичной диагностики.

Наиболее подходящим методом для экспресс идентификации ортопоксвирусов, патогенных для человека, может быть ПЦР в реальном времени. На основе этого метода создан ряд методик для родоспецифичной идентификации и дифференциации одного из видов ортопоксвирусов. Коммерчески доступной является тест-система для исследовательских целей для родоспецифичного выявления ортопоксвирусов с последующей дифференциацией анализом температуры плавления вируса натуральной оспы. Однако метод одновременной дифференциации VARV, MPXV, CPXV и VACV в одной реакционной смеси до сих пор не создан.

В результате сравнительного компьютерного анализа нуклеотидных последовательностей геномных ДНК 85 штаммов шести видов ортопоксвирусов выявлены видоспецифичные районы VARV, MPXV, CPXV и VACV, перспективные для видоспецифичной ПЦР идентификации вирусных ДНК.

Впервые разработан метод видоспецифичной идентификации вируса оспы коров, на основе ПЦР в реальном времени. Определены основные аналитические характеристики этого метода, которые в условиях эксперимента (на приборе Applied Biosystems 7500) составили: 1) аналитическая чувствительность, определенная при помощи рекомбинантной плазмиды, содержащей видоспецифичные районы CPXV: 2-20 копий/реакции. 2) аналитическая чувствительность, определенная при помощи препарата полноразмерной ДНК CPXV: 6-60 копий/реакции. 3) диагностическая чувствительность – 100%; 4) аналитическая специфичность – 100%; 5) диагностическая специфичность – 100%.

Впервые разработан метод одновременной видоспецифичной диагностики вирусов натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров и осповакцины на основе мультиплексной ПЦР в реальном времени. Определены основные аналитические характеристики этого метода, которые в условиях эксперимента составили: 1) аналитическая чувствительность, определенная при помощи рекомбинантных плазмид, содержащих видоспецифичные районы OPV: VARV - 2-20 копий/реакции, MPXV - 2-20 копий/реакции, CPXV - 5-50 копий/реакции, VACV - 7-70 копий/реакции. 2) аналитическая чувствительность, определенная при помощи препаратов полноразмерной ДНК OPV: CPXV – 2-20 копий/реакции, VACV – 9-90 копий/реакции. 3) диагностическая чувствительность – 100%; 4) аналитическая специфичность – 100%; 5) диагностическая специфичность – 100%. (См. диссертацию "Метод видоспецифичной идентификации патогенных для человека ортопоксвирусов на основе мультиплексной ПЦР в реальном времени").

Щербаков Д.Н. Автореф. дис. канд. биол. наук. Кольцово, 2010.

Все новости

ФБУН НИИ эпидемиологии
и микробиологии имени Пастера
Отдел новых технологий