Материалы и методы исследования

Материалы

Реактивы, используемые для проведения электрофореза ДНК и белков в агарозном и полиакриламидном гелях производства фирмы «Sigma-Aldrich» (США). Дрожжевой экстракт, бакто-триптон, агар фирмы «Difco» (Великобритания). Ni-NTA-сефароза 6В-CL, набор для выделения ДНК из агарозного геля фирмы «Qiagen» (США). Фенол, лизоцим, хлороформ, этанол, кислоты, щелочи, соли квалификации «ХЧ» или «ОСЧ» производства «Реахим» (Россия).

Ферменты: ДНК-полимераза Phusion («Finnzymes», Финляндия), ДНК-лигаза бактериофага Т4, эндонуклеазы рестрикции фирмы «Сибэнзим» (Россия).

Штаммы Escherichia coli: BL21 (DE3) и Rosetta 2 (DE3).

Плазмидные векторные ДНК:

  • pET36b(+) («Novagen», США);
  • pETm-cbd - модифицированный нами вектор pET36b(+), в котором за нуклеотидной последовательностью целлюлозосвязывающего домена эндоглюконазы А (CBDCenA) из Cellumonas fimi следует встроенная последовательность полилинкера, включающего сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции в указанной последовательности: AgeI, EcoRI, KpnI, BssHII, BstEII, HindIII, XhoI;
  • pJExpress401-esat6-cfp10 («DNA2.0», США).

Коммерческие антигены Mtb: антиген PPDN-3, который представляет собой ультрафильтрат культур возбудителя туберкулеза штаммов DТSТ и Valee и используется в тест-системе «ИФА-анти-ТУБ», выпускаемой Отделом Новых Технологий ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера (г. Санкт-Петербург).

Биологический материал: образцы сывороток крови были получены от больных туберкулезом (БЛ) легких (n=321), проходивших стационарный этап лечения в СПБ ГУЗ ПТБ № 3 в 2011 - 2012 г. в возрасте от 18 до 76 лет (54 % мужчин, 46 % женщин), средний возраст составил 38 лет (30 для мужчин и 48 для женщин). У 71 % больных имел место инфильтративный ТБ легких, у 14 % - фиброзно-кавернозный ТБ. Оставшиеся 15 % составили больные казеозной пневмонией, очаговым ТБ, диссеминированным ТБ и туберкулемой. У 86 % больных диагноз ТБ был подтвержден микроскопией мокроты или культуральным методом (посев мокроты). 52 % составили больные с впервые выявленным ТБ, оставшиеся 48 % - с хроническим ТБ процессом. Сыворотки крови были получены также и от больных с заболеваниями легких нетуберкулезной этиологии (НЗЛ): больные саркоидозом (n=40) и пневмонией (n=28), находившихся на лечении в СПБ ГУЗ ГМПБ № 2. Для подтверждения диагноза саркоидоза у 30 % пациентов проводилась чрезбронхиальная биопсия с гистологическим исследованием препарата, окраска по Цилю-Нильсену, а также ПЦР смывов из ТБД на МБТ. У 70 % активность ангиотензинпревращающего фермента была выше, чем верхняя граница референтного интервала 70 ед./мл.

Были исследованы также сыворотки крови здоровых сотрудников противотуберкулезных учреждений (n=42), имеющих профессиональный контакт с больными ТБ не менее 1 года, не имеющие клинических и радиографических признаков активного ТБ (контактные лица, КЛ) в возрасте от 25 до 73 лет (18 % мужчин, 82 % женщин), средний возраст составил 48 лет (37,5 для мужчин и 57 для женщин). Группу сравнения составили 366 здоровых доноров (ЗЛ). Все лица, включенные в исследование (n=797), не были инфицированы ВИЧ.

Методы

Оптимизация первичной структуры химерного гена «esat6-cfp10». Нуклеотидную последовательность искусственного химерного гена, кодирующего полипептид, включающий полноразмерные аминокислотные последовательности белков ESAT6 и CFP10 Mtb, проектировали с использованием компьютерной программы GeneDesigner 2.0 фирмы DNA 2.0 (США), обеспечивающей оптимизацию кодонов в гене для эффективной его экспрессии в клетках E.coli. Кроме того, с применением разработанной нами программы проводили поиск пар кодонов, которые по литературным данным [10] затрудняют или даже останавливают трансляцию мРНК в E.coli, и заменяли их на синонимические кодоны.

Сборка и клонирование химерных генов «cbd-cfp10» и «cbd-esat6». Гены белков ESAT6 и CFP10 в составе вектора pJExpress401/esat6-cfp10 амплифицировали методом ПЦР с использованием соответствующих пар праймеров. Прямой и обратный праймеры, предназначенные для амплификации генов esat6 и cfp10, содержали на 5'-концах дополнительные последовательности, включающие сайты рестрикции AgeI и EcoRI (для гена esat6) и EcoRI и XhoI (для гена cfp10), соответственно. Полученные ампликоны после гидролиза эндонуклеазами рестрикции встраивали по этим сайтам в полилинкер плазмиды pETm/cbd, гидролизованной соответствующими рестриктазами, с использованием ДНК-лигазы фага Т4. Продукты гидролиза ДНК эндонуклеазами рестрикции и ампликоны генов анализировали с помощью электрофореза в 5 - 12 % ПААГ или в 0,8 – 2 % агарозном геле [3]. Последующие процедуры трансформации электрокомпетентных клеток E.coli BL21 (DE3) лигазными смесями, отбора рекомбинантных клонов на селективной среде и их анализа на наличие целевых ДНК-вставок проводили, как было описано нами ранее, для получения штамма E.coli - продуцента химерного белка «CBD-P38» [2].

Анализ экспрессии генов рекомбинантных химерных белков. Об экспрессии клонированных генов судили по данным электрофореза белков из лизатов клеток рекомбинантных клонов E.coli, проводившегося в пластинах полиакриламидного геля в денатурирующих условиях по методу Лэммли. Определение внутриклеточной локализации рекомбинантных химерных белков осуществляли согласно методике [15].

Выделение и очистка рекомбинантных белков. Клетки отобранных рекомбинантных клонов E.coli, продуцирующих химерные белки, выращивали в колбах вместимостью 2 л, содержащих 400 мл среды LB (0,5 % дрожжевого экстракта, 1 % триптона и 0,5 % NaCl) в присутствие 30 мкг/мл канамицина на орбитальном шейкере при 37 °С 120 об./мин. до оптической плотности OD600=1,0. Затем в культуру вносили ИПТГ до конечной концентрации 0,5 - 1 mM и продолжали выращивание клеток в течение ночи при 30 °С. Клетки осаждали центрифугированием при 5000 хg, 10 мин. Осадок клеток суспендировали в буфере, содержащем 50 mM Na-фосфат pH 8.0, 300 mM NaCl, из расчёта 3 - 5 мл буфера на 1 г веса клеток. В суспензию вносили лизоцим до конечной концентрации 1 - 2 мг/мл, инкубировали во льду 30 мин. и затем озвучивали суспензию в ледяной ванне 6 - 8 раз по 20 - 30 сек. на максимальной мощности (200 - 300 Ватт) УЗ-дезинтегратора. “Озвученную” суспензию освобождали от клеточного дебриса центрифугированием при 5000 хg 10 мин., а супернатант центрифугировали при + 4 °С 30 мин. при 40 000 хg. В надосадочной жидкости должны содержаться рекомбинантные антигены в растворимом состоянии, а в осадке телец включения - рекомбинантные белки в нерастворимой форме. В зависимости от локализации рекомбинантного белка в клетках E.coli (в растворимом состоянии в цитоплазме или в нерастворимом виде в тельцах включения) проводили аффинную хроматографию на колонке с Ni2+-NTA-сефарозе 6B-CL соответственно в нативных либо в денатурирующих условиях [2].

Получение лизата клеток E.coli для истощения исследуемых сывороток от антител к антигенам E.coli. Из выращенных клеток штаммов E.coli BL-21 (DE3) или Rosetta 2 (DE3), не содержащих рекомбинантных плазмид, получали “озвученные” суспензии как описано выше. После центрифугирования суспензий при +4 оС 30 мин. при 40 000 хg отбирали супернатант, расфасовывали его аликвотами по 1 - 2 мл и хранили при (минус 20 – минус 70) оС. Полученные супернатанты использовали в иммуноферментном анализе для истощения исследуемых сывороток от антител к антигенам E.coli.

Определение концентрации белка. Концентрацию рекомбинантного белка определяли по Лоури либо флуоресцентным методом при помощи прибора и набора Qubit® (Invitrogen, USA) согласно инструкции фирмы.

Твёрдофазный иммуноферментный анализ. Непрямой вариант ИФА для обнаружения IgG антител к полученным антигенам (ПТА) проводили по методике с использованием реагентов из набора «ИФА-анти-ТУБ», производства ФБУН НИИ имени Пастера (г. Санкт-Петербург). С целью определения оптимальной концентрации исследуемые антигены наносили в лунки планшета (Nunc Polysorp, Дания) в концентрациях от 10 до 0,05 мкг/лунку и проводили ИФА. Результаты определения показали, что 1 мкг антигенов на лунку является оптимальной дозой, при которой разница между оптической плотностью положительного и отрицательного пула является максимальной.

Статистическая обработка данных. Для статистической обработки полученных данных использовали пакеты программ MS Excel, SPSS (версия 13.0), Prizm 5.0 (GraphPad Software Inc.). Полученные данные представлены в виде медианы с указанием первого и третьего квартиля Me [Q1; Q3]. Для сравнения парных количественных значений использовали непараметрический критерий Манна-Уитни. Гипотезы рассматривались как статистически достоверные при p<0,05. Для оценки диагностической ценности ИФА с использованием указанных антигенов и выбора порогового значения применяли анализ характеристической кривой (receiver-operating-characteristic curve-ROC) с вычислением площади под характеристической кривой операционной характеристики (ППК). Для корреляционного анализа рядов данных использован метод ранговой корреляции по Спирмену.

Выбрать другой раздел данной публикации
Все публикации

ФБУН НИИ эпидемиологии
и микробиологии имени Пастера
Отдел новых технологий