Результаты и обсуждение

Ранее нами был сконструирован штамм E.coli Rosetta 2 (DE3), содержащий рекомбинантную плазмиду pET36b(+)/p38 и продуцирующий химерный полипептид с молекулярной массой ~ 60 кДа. Химерный полипептид содержал в N-концевой области аминокислотную последовательность CBDCenA, в С-концевой области - полноразмерную аминокислотную последовательность зрелого белка P38 Mtb [2]. На долю синтезированного химерного белка приходилось ~ 25 % от общего содержания белков в клетке.

Спроектированный нами химерный ген esat6-cfp10 был синтезирован фирмой DNA 2.0 (США). Ген был клонирован в клетках E.coli BL21 (DE3) в составе вектора pJExpress401, обеспечивающего индуцируемую ИПТГ экспрессию этого гена под контролем промотора бактериофага Т5. Отобранные рекомбинантные клоны анализировали на продукцию целевого белка – химерного белка ESAT6-CFP10 с помощью электрофореза лизата клеток в 12 % ДСН-ПААГ. В исследованных рекомбинантных клонах наблюдался индуцируемый ИПТГ синтез полипептида с молекулярной массой ~ 24 - 25 кДа, соответствующей расчётной для химерного белка ESAT6-CFP10. На долю синтезированного химерного белка приходилось ~ 15 % от общего содержания белков в клетке. Один из отобранных клонов использовали как для наработки рекомбинантного химерного белка ESAT6-CFP10, так и для получения плазмиды, служившей в дальнейшей работе в качестве матрицы при амплификации синтетических генов белков ESAT6 и CFP10. Ампликоны генов белков ESAT6 и CFP10 по отдельности клонировали в составе экспрессирующего вектора pETm/cbd в клетках E.coli BL21 (DE3). В результате лигирования целевых синтетических генов с плазмидным вектором pETm/cbd встраиваемые ДНК «сшивались» с нуклеотидной последовательностью вектора, кодирующей целлюлозосвязывающий домен CBDCenA, с образованием химерных генов «cbd-cfp10» и «cbd-esat6». Получение рекомбинантных белков CBD-P38, CBD-ESAT6 и CBD-CFP10 в виде «сшитых» с CBDCenA химер обусловлено необходимостью увеличения сорбции рекомбинантных антигенов на полистирольном планшете за счёт полипептидной цепи CBDCenA, содержащей протяжённые гидрофобные участки, способствующие связыванию с гидрофобной поверхностью полистирола. На рисунке 1 представлены схемы структур полипептидов, кодируемых сконструированными химерными генами.

Рис.1. Схемы структур химерных белков.

Signal: N-концевая лидерная аминокислотная последовательность сигнала секреции;
CBD: аминокислотная последовательность целлюлозосвязывающего домена эндоглюконазы А из Cellumonas fimi;
ESAT6: аминокислотная последовательность белка ESAT6 из M. tuberculosis;
CFP10: аминокислотная последовательность белка CFP10 из M. tuberculosis;
Mature P38: аминокислотная последовательность зрелого белка P38 из M. tuberculosis;
MCS: аминокислотная последовательность, кодируемая полилинкером вектора pET36b(+);
8xHis: С-концевая аминокислотная последовательность из 8-ми гистидиновых остатков.
В скобках указано количество аминокислотных остатков (а.a.), входящих в полипептид.

Сконструированными рекомбинантными плазмидами, содержащими химерные гены, трансформировали клетки E.coli BL21 (DE3). Клоны, отобранные методом ПЦР колоний, исследовали на способность продуцировать целевые химерные белки, а также определяли и внутриклеточную локализацию этих белков. По данным электрофоретического анализа белков в ПААГ клоны, содержащие рекомбинантные плазмиды pETm/cbd-cfp10 и pETm/cbd-esat6, продуцировали полипептиды с молекулярными массами, соответствующими расчётным для белков CBD-CFP10 и CBD-ESAT6, соответственно. На долю синтезированных белков CBD-CFP10 и CBD-ESAT6 приходилось, соответственно, 45 % и 50 % от суммарного белка клеток. Рекомбинантные белки были очищены с помощью аффинной хроматографии на колонках с Ni2+-NTA-сефарозе 6B-CL. Степень очистки составляла 90 – 95 %. Очищенные белки были использованы в дальнейшей работе по исследованию их антигенных свойств.

Во всех образцах сывороток крови (n=729) с помощью непрямого варианта ИФА были определены уровни IgG-антител (ПТА) против всех антигенов. C целью определения оптимального порогового значения был проведен ROC-анализ. На основании полученных данных были построены характеристические ROC-кривые, выбраны пороговые значения при фиксированной специфичности 80 %, и проведен анализ частоты выявляемости патологических результатов (> порогового значения). Результаты представлены в таблице 1. У 44 % здоровых лиц были обнаружены ПТА хотя бы к одному антигену. Из 275 больных ТБ с бактериовыделением лишь у 13,5 % результат ИФА ко всем исследуемым антигенам был отрицательным, в то время как у больных без бактериовыделения процент отрицательных результатов составил 30 %. Достоверные различия между группой БЛ с бактериовыделением и с БЛ без бактериовыделения вне зависимости от стадии ТБ процесса обнаружены при определении ПТА только к PPDN-3, CBD-P38 и CBD-CFP10 (p<0,0001). Кроме того, использование PPDN3 позволяет достоверно различить группы БЛ и КЛ (p<0,0001). Следовательно, PPDN3 может применяться для выявления активного ТБ. Важно отметить, что БЛ по сравнению с КЛ, имеющими высокий риск инфицирования, не отличаются между собой (p>0,05) по содержанию ПТА против ESAT6-CFP10 и CBD-CFP10. Для этих антигенов нет значимых различий и при сопоставлении БЛ с бактериовыделением (n=271) и БЛ без бактериовыделения (n=50). Следовательно, ESAT6-CFP10 и CBD-CFP10 могут использоваться для выявления ТБ инфицирования (в независимости от наличия клинических проявлений ТБ и наличия бактериовыделения). У лиц с заболеваниями нетуберкулезной этиологии также были обнаружены достоверные различия по сравнению с группой БЛ при определении ПТА к PPDN-3, ESAT6-CFP10 и CBD-CFP10 (p<0,05).

Таблица 1. Частота положительных результатов в группах обследованных.

Группа Статус Число образцов Частота положительных результатов, %
ESAT6-CFP10 CBD-CFP10 CBD-ESAT6 PPDN-3 CBD-P38
Пороговое значение*, OD450     0,52 0,74 1,11 0,36 0,50
Здоровые доноры   366 20 20 20 20 20
Больные ТБ ВП БК+ 128 25 37 14 57 37
ВП БК- 39 13 21 21 16 10
ХР БК+ 147 20 30 26 78 43
ХР БК- 7 29 14 58 58 59
Всего 321 21 32 22 62 36
Контактные по ТБ   42 29 38 12 4 21
Саркоидоз легких   40 3 0 0 3 5
Пневмония   28 25 18 11 4 4
Примечание:
ВП – впервые выявленные больные ТБ до начала лечения;
ХР – больные хроническим ТБ;
БК+/- – с наличием/отсутствием бактериовыделения, подтвержденного микроскопией или микробиологическим методом (посев мокроты);
* – пороговое значение установлено при построении ROC-кривой при фиксированной специфичности 80 % для каждого антигена.

Для того чтобы выяснить роль каждого антигена в составе антигенных композиций для диагностических тест-систем, был проведен корреляционный анализ данных об уровнях антител против каждого антигена. Проведенные расчеты выявили наличие достоверной положительной корреляции между уровнями антител против всех антигенов (CBD-P38, ESAT6-CFP10, CBD-CFP10, CBD-ESAT6, PPDN-3), которые сравнивались попарно. Это говорит о том, что у значительной части больных уровень антител к любому из пяти антигенов, по всей видимости, определяется общим уровнем гуморального иммунного ответа против Mtb. Но поскольку во всех случаях коэффициент корреляции Спирмена (R) не превышал 0,67 (т.е. выявленная корреляция между уровнями антител к изучаемым антигенам не была абсолютной), то данные антигены отличаются в значительной степени по своим антигенным и иммунобиологическим свойствам и, вероятно, не могут заменить друг друга в составе антигенных диагностических композиций.

Поскольку чувствительность и специфичность связаны между собой обратной связью, то мы не можем вводить бесконечное количество антигенов в композицию, так как после добавления каждого последующего антигена помимо увеличения чувствительности мы наблюдаем уменьшение специфичности. Так, при совместном использовании PPDN-3, CBD-P38 и ESAT6-CFP10, чувствительность выявления БЛ, в независимости от наличия бактериовыделения, стремилась к 95 %, при этом специфичность составила всего 65 %. В ходе проведенного анализа было установлено, что сочетание двух антигенов PPDN-3 и CBD-P38 наименее снижает специфичность выявления ЗЛ (76 %), при этом чувствительность в разных группах возрастает, достигая 90 % в группе БЛ хроническим ТБ процессом (МБТ+), 74 % у БЛ впервые выявленным ТБ (МБТ+) и 60 % у БЛ (МБТ-) в независимости от характера процесса. Специфичность диагностики лиц с НЗЛ остается прежней в группе БЛ пневмонией (96 %) и немного уменьшается в группе БЛ саркоидозом легких, составляя 92 %. Таким образом, белки PPDN-3 и CBD-P38 могут найти применение в ИФА тест-системах для выявления лиц с активным ТБ процессом и проведения дифференциальной диагностики ТБ с другой легочной патологией. ESAT6-CFP10 и CBD-CFP10 могут быть использованы для разработки тестов для выявления инфицирования Mtb, однако необходимо решить вопрос об увеличении специфичности проведения анализа, в том числе и за счет изменения условий синтеза данных белков.

Работа частично поддержана грантом молодых ученых ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера.

Выбрать другой раздел данной публикации
Все публикации

ФБУН НИИ эпидемиологии
и микробиологии имени Пастера
Отдел новых технологий