Набор реагентов для одновременного выявления и определения антибиотикочувствительности Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis "уреа/мико-скрин-ач"

Назначение набора "уреа/мико-скрин-ач"

Набор реагентов "уреа/мико-скрин-ач" предназначен для одновременного выявления, идентификации, полуколичественной оценки титра и определения антибиотикочувствительности двух видов урогенитальных микоплазм: Ureaplasma urealyticum (U. u.) и Mycoplasma hominis (M. h.).

Набор рассчитан на проведение 12 анализов, включая контроли.

Принцип метода набора "уреа/мико-скрин-ач"

В лунки первого стрипа, содержащего различные специфические реагенты, вносят селективную питательную среду, а затем раститрованную исследуемую пробу. При этом среда в лунках, предназначенных для обнаружения, идентификации и полуколичественной оценки титра U. u., окрашивается в желтый цвет, а среда в лунках, предназначенных для обнаружения, идентификации и полуколичественной оценки титра M. h., окрашивается в зеленый цвет. В процессе роста микоплазм образуются продукты метаболизма, которые приводят к изменению pH сред. Визуально это проявляется в изменении цвета сред. Цвет среды для U. u. меняется от желтого до красного или красно-малинового, для M. h. - от зеленого до фиолетового.

В лунках других двух стрипов сорбированы антибиотики. После внесения в эти лунки инокулята сорбированные антибиотики растворяются. В тех лунках, где антибиотики подавляют рост урогенитальных микоплазм, изменение цвета среды не происходит и штамм считается чувствительным к данным антибиотикам. В тех лунках, где антибиотики не подавляют рост урогенитальных микоплазм, происходит изменение цвета среды и штамм считается резистентным к данным антибиотикам.

Состав набора "уреа/мико-скрин-ач"

8-луночные стрипы с сорбированными субстратами - 12 шт.
8-луночные стрипы с сорбированными антибиотиками и субстратами - 24 шт.
Питательная среда для выявления M. h. и U. u., лиофилизированная - 2 фл.
Транспортная среда для урогенитальных микоплазм, лиофилизированная - 1 фл.
Пробирки для микропроб - 48 шт.
Масло вазелиновое - 1 фл. (20 мл).
Этикетки для маркировки пробирок - 12 шт.

Меры предосторожности при работе с набором "уреа/мико-скрин-ач"

Потенциальный риск применения набора - класс 2а.

Набор "уреа/мико-скрин-ач" предназначен только для in vitro диагностики.

Входящие в компоненты набора вещества инактивированы и безопасны. Однако исследуемые клинические материалы, а также сточные растворы, оборудование и материалы, находящиеся с ними в контакте, представляют собой потенциально инфекционный материал, и обращаться с ними следует, соблюдая технику безопасности.

Следует избегать любого контакта компонентов набора со слизистыми оболочками.

При работе с набором следует соблюдать "Правила устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения СССР" (Москва, 1981 г.).

Оборудование и материалы для работы с набором "уреа/мико-скрин-ач"

термостат, поддерживающий температуру 37 ± 1 °С;
дозаторы пипеточные;
горелка газовая (спиртовка);
вода дистиллированная.

Проведение анализа на базе набора "уреа/мико-скрин-ач"

Приготовление жидкой питательной среды

Во флаконы с лиофилизированной питательной средой для выявления M. h. и U. u. внести по 15 мл дистиллированной воды. Содержимое флаконов перемешать до полного растворения (в течение 1 мин.). Полученный прозрачный раствор желтого цвета разлить по 0,85 мл в пробирки для микропроб (12 пробирок для приготовления инокулятов на антибиотикочувствительность M. h. и 12 пробирок для приготовления инокулятов на антибиотикочувствительность U. u.) и по 0,8 мл в 12 пробирок для микропроб (для контролей). Пробирки закрыть, промаркировать и хранить при температуре 2 - 8 °С не более 7 сут. или при температуре минус 7 °С и ниже не более 2 мес.

Перед проведением анализа пробирки со средой выдержать при температуре (18 - 25 °С) в течение 1 ч. Растворы в пробирках должны быть прозрачными, желтого цвета.

В случае помутнения раствора или образования видимых хлопьев и осадка пробирки со средой в работе не использовать!
Приготовление транспортной среды для урогенитальных микоплазм

Во флакон с лиофилизированной транспортной средой для урогенитальных микоплазм внести 10 мл дистиллированной воды. Содержимое флакона перемешать до полного растворения (в течение 1 мин.). Полученный прозрачный раствор светло-желтого цвета разлить в 12 пробирок по 0,5 мл. Пробирки закрыть, промаркировать и хранить при температуре 2 - 8 °С не более 7 сут. или при температуре минус 7 °С и ниже не более 2 мес.

Перед проведением анализа пробирки со средой выдержать при температуре (18 - 25 °С) в течение 1 ч. Растворы в пробирках должны быть прозрачными, светло-желтого цвета.

В случае помутнения раствора или образования видимых хлопьев и осадка пробирки со средой в работе не использовать!
Приготовление проб для исследования

Для обнаружения M. h./U. u. пригодны следующие биологические материалы: отделяемое влагалища, отделяемое шейки матки, отделяемое уретры, сперма, центрифугат мочи. Забор проб осуществлять с помощью ложки Фолькмана или одноразового тампона (щетки)¹.

Исследуемые пробы внести в пробирки, содержащие 0,5 мл транспортной среды для урогенитальных микоплазм. Пробирки с пробами закрыть, промаркировать и доставить в лабораторию. Время транспортировки не должно превышать 8 - 12 ч при температуре не выше 6 - 10 °С.

¹Методические указания от 11.03.2003 г. "Обеспечение качества подготовки образцов биологических материалов для цитологических исследований" МЗ РФ, Москва, 2003 г.
Проведение теста

Далее описана процедура для одного анализа (см. рис. 1).

Выделение и идентификация урогенитальных микоплазм.

Использовать стрип без полосок. Из пробирки, содержащей 0,8 мл питательной среды без пробы, внести по 90 мкл раствора во все лунки стрипа.

Затем из пробирки, содержащей транспортную среду с исследуемой пробой (0,5 мл), добавить 10 мкл в лунку N₁, тщательно перемешать пипетированием и перенести 10 мкл раствора из лунки N₁ в лунку N₂ (разведение в 10 раз) и перемешать пипетированием. Затем перенести 10 мкл раствора из лунки N₂ в лунку N₃ (разведение в 100 раз) и перемешать пипетированием.

Сменив наконечник пипетки, из той же пробирки с транспортной средой и исследуемой пробой внести 10 мкл раствора в лунку N₅, тщательно перемешать раствор пипетированием и перенести 10 мкл из лунки N₅ в лунку N₆ (разведение в 10 раз) и перемешать пипетированием. Затем перенести 10 мкл раствора из лунки N₆ в лунку N₇ (разведение в 100 раз) и перемешать пипетированием.

Во все лунки добавить по 2 - 3 капли (50 - 75 мкл) вазелинового масла. Стрип поместить в термостат при температуре 37 ± 1 °С.

Определение антибиотикочувствительности.

Готовят два инокулята добавлением по 85 мкл раствора из пробирки, содержащей транспортную среду с исследуемой пробой в транспортной среде (0,5 мл), в две пробирки с жидкой питательной средой для выявления M. h. и U. u. (0,85 мл).

Во все лунки стрипов с красной и зеленой полосками (стрипы с антибиотиками) внести по 100 мкл приготовленных двух инокулятов. Оба стрипа осторожно перемешать встряхиванием до растворения сорбированных субстратов. Во все лунки стрипов добавить по 2 - 3 капли (50 - 75 мкл) вазелинового масла и стрипы поместить в термостат при температуре 37 ± 1 °С.

Рис. 1. Схема расположения сред и проб в лунках стрипов.

Учет и интерпретация результатов

Учет результатов проводить через 24 ч для U. u. (лунки N_1-4) и для M. h. (лунки N_5-8). Окончательный учет результатов проводить через 48 ч для U. u. (лунки N_1-4) и через 72 ч для M. h. (лунки N_5-8). Изменение окрасок сред в лунках стрипа оцениваются визуально: при изменении цвета "+", при отсутствии изменения цвета "-".

Качественный анализ

Появление красной или красно-малиновой окраски среды (без помутнения) в одной или нескольких лунках N₁, N₂ и N₃ с положительными контролями К(+++), К(++) и К(+) при сохранении исходной желтой окраски среды в контрольной лунке N₄ с К(-) свидетельствует о том, что в исследуемой пробе присутствует U. u., т.е. результат является положительным.

Отсутствие изменений окраски среды (без помутнения) в лунках N₁, N₂ и N₃ с положительными контролями К(+++), К(++) и К(+) при сохранении исходной желтой окраски среды в контрольной лунке N₄ с К(-) свидетельствует о том, что в исследуемой пробе отсутствует U. u., т.е. результат является отрицательным.

Появление фиолетовой окраски среды (без помутнения) в одной или нескольких лунках N₅, N₆ и N₇ с положительными контролями К(+++), К(++) и К(+) при сохранении исходной зеленой окраски среды в контрольной лунке N₈ с К(-) свидетельствует о том, что в исследуемой пробе присутствует M. h., т.е. результат является положительным.

Отсутствие изменений окраски среды (без помутнения) в лунках N₅, N₆ и N₇ при сохранении исходной зеленой окраски среды в контрольной лунке N₈ с К(-) свидетельствует о том, что в исследуемой пробе отсутствуют M. h., т.е. результат является отрицательным.

Помутнение среды (при изменении или без изменения окраски) в какой-либо из лунок свидетельствует о росте посторонней микрофлоры. Результаты исследований таких проб учету не подлежат и требуют повторного проведения анализа или дополнительного посева образца на плотную питательную среду U. u. и (или) M. h.

Полуколичественная оценка титра

Изменение окраски среды только в лунке N₁ (или N₅) с К(+++) при отсутствии изменений в окраске среды в лунках N₂, N₃ и N₄ (или N₆, N₇ и N₈) с К(++), К(+) и К(-) указывает на то, что титры соответствующих возбудителей составляют не более 10² колониеобразующих единиц в мл (КОЕ/мл).

Изменение окраски среды только в лунках N₁, N₂ (или N₅, N₆) с К(+++) и К(++) при отсутствии изменений в окраске среды в лунке N₃ и N₄ (или N₇ и N₈) с К(+) и К(-) указывает на то, что титры соответствующих возбудителей составляют не более 10³ (КОЕ/мл).

Изменение окраски среды в лунках N₁, N₂, N₃ (или N₅, N₆, N₇) с К(+++), К(++) и К(+) при отсутствии изменения в окраске среды в лунке N₄ (или N₈) с К(-) указывает на то, что титры соответствующих возбудителей составляют не менее 10⁴ (КОЕ/мл).

Примечание. В исследуемой пробе могут одновременно обнаруживаться U. u. и M. h., что свидетельствует о смешенной инфекции или носительстве.

Определение антибиотикочувствительности

При изменении цвета среды "+" в лунках стрипа с антибиотиками (красная полоска) штамм U. u. расценивается как резистентный (R). При отсутствии изменения цвета среды "-" - как чувствительный (S).

При изменении цвета среды "+" в лунках стрипа с антибиотиками (зеленая полоска) штамм M. h. расценивается как резистентный (R). При отсутствии изменения цвета среды "-" - как чувствительный (S).

Условия хранения и эксплуатации набора "уреа/мико-скрин-ач"

Набор "уреа/мико-скрин-ач" следует хранить при температуре 2 - 8 °С в упаковке предприятия-изготовителя в течение всего срока годности. Допускается хранение набора при температуре до 25 °С не более 2 недель.
Срок годности набора - 12 мес.
Приготовленную питательную среду можно хранить при температуре 2 - 8 °С не более 1 недели или при температуре минус 7 °С и ниже не более 2 мес.
Для получения надежных результатов необходимо строгое соблюдение инструкции по применению набора.
По вопросам, касающимся качества набора УРЕА/МИКО-СКРИН-АЧ, следует обращаться в ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера:
адрес: 197101, Санкт-Петербург, ул. Мира, 14;
тел./факс: (812) 233-17-03, (812) 346-83-87;
телефон (812) 325-27-10, (812) 346-83-86;
веб-сайт: http://www.dntpasteur.ru;
e-mail: pasteurdnt@yandex.ru.