Набор для выявления антител класса IgM к лептоспирам серологических групп Icterohaemorrhagiae и Canicola

Биологические и иммунологические свойства

Тест-система иммуноферментная для выявления антител класса IgM к лептоспирам серологических групп Icterohaemorrhagiae и Canicola обладает способностью выявлять IgM-антитела к лептоспирам серологических групп Icterohaemorrhagiae и Canicola в сыворотках крови больных на сравнительно ранних сроках болезни за счет их связывания со специфическими антигенами, сорбированными на поверхности лунок стрипов. Образующийся комплекс антиген-антитело выявляется с помощью пероксидазного коньюгата на основе моноклональных антител к тяжелой цепи IgМ человека по появлению желто-коричневого окрашивания на этапе ферментативного превращения субстратного раствора.

Несмотря на то, что входящие в тест-систему иммуноферментную для выявления антител класса IgM к лептоспирам серологических групп Icterohaemorrhagiae и Canicola контрольные сыворотки (К⁺, К^-) инактивированы, с системой следует обращаться как с потенциально инфекционным материалом:

работать в резиновых перчатках;
не пипетировать ртом;
все использованные материалы подвергать обработке дезинфицирующими растворами (6 % раствором перекиси водорода или монохлорамина);
использованные наконечники обрабатывать 20 % раствором этилового спирта.

Назначение

Тест-система иммуноферментная для выявления антител класса IgM к лептоспирам серологических групп Icterohaemorrhagiae и Canicola предназначена для серологической диагностики лептоспироза. Может быть использована при проведении текущей и ретроспективной диагностики лептоспироза при эпидемиологических исследованиях.

Состав набора

Восьмилуночные стрипы, сорбированные Леп-антигеном, (Леп-антиген) - 12 шт.
Сыворотка, содержащая IgM антитела к лептоспирам, (К⁺), 1,2 мл, (красный раствор) - 1 пр.
Сыворотка, не содержащая IgM антител к лептоспирам, (К^-), 1,2 мл, (зеленый раствор) - 1 пр.
Концентрат конъюгата - моноклональные IgМ-антитела, меченные пероксидазой хрена, (Концентрат конъюгата), 0,2 мл, (синий раствор) - 1 пр.
Концентрат фосфатно-солевого буферного раствора, содержащий детергент, (ФСРТ), 20,0 мл, (бесцветный раствор) - 1 фл.
Раствор для исследуемых проб, (РИП), 10,0 мл - 2 фл.
Цитратный буферный раствор с перекисью водорода, (ЦБП), 10,0 мл - 1 фл.
Раствор для разведения конъюгата, (РРК), 10,0 мл - 1 фл.
Раствор тетраметилбензидина, (ТМБ), (бесцветный или слегка голубоватый раствор), 2,5 мл - 1 фл.
Раствор серной кислоты, (Стоп реагент), 5,0 мл, (бесцветный раствор) - 1 фл.
Полиэтиленовый пакет с молнией - 1 шт.
Инструкция по применению - 1 шт.

Подготовка реагентов

Все растворы и реагенты необходимо выдержать перед началом работы при температуре (15 - 25) °С в течение 30 мин. Иммуноферментный анализ (ИФА) рекомендуется проводить с использованием новых, не подвергавшихся обработке наконечников для пипеток.
В зависимости от числа исследуемых проб отбирают необходимое количество стрипов (полосок по 8 лунок в каждой). Остальные стрипы вынимают из рамки-держателя и хранят в закрытом полиэтиленовом мешке с молнией.
Растворы каждого компонента тест-системы иммуноферментной для выявления антител класса IgM к лептоспирам серологических групп Icterohaemorrhagiae и Canicola и каждого исследуемого образца необходимо брать с помощью индивидуального наконечника для пипеток.
Раствор ФСРТ. Для получения рабочего раствора содержимое флакона с концентратом ФСРТ доводят до 500 мл дистиллированной водой. Раствор хранят до 4 мес при температуре (4 - 6) °С.
Исследуемые сыворотки. Для получения необходимого (1:400) разведения следует произвести предварительное разведение, смешав 95 мкл синего раствора РИП с 5 мкл исследуемой сыворотки с (разведение - 1:20), используя дополнительный неразборный планшет; при этом цвет раствора изменится от синего до изумрудного. Разведённую сыворотку не хранить.
Раствор конъюгата. Концентрат конъюгата разводят на растворе РРК 1:80. Необходимый объем раствора конъюгата определяется числом используемых стрипов (см. пример 1). Хранят до 4 ч при температуре (4 - 6) °С.
Субстратный раствор. Готовят перед проведением ферментативной реакции. Необходимый объем раствора субстрата определяется числом используемых стрипов (см. пример 1). Хранению не подлежит.
Пример 1. Таблица расхода компонентов тест-системы иммуноферментной для выявления антител класса IgM к лептоспирам серологических групп Icterohaemorrhagiae и Canicola

Проведение иммуноферментного анализа

Для выявления антител к антигенам лептоспир возможно использование сыворотки крови людей как свежей, так и хранившейся при 2 - 10 °С не более 48 часов после забора крови, либо замороженной и хранившейся (исключить промежуточное оттаивание) при минус 20 °С не более 6 месяцев.

Гидратация сорбированного леп-антигена. Во все лунки стрипов вносят по 200 мкл раствора ФСРТ. Инкубируют в течение (1 - 2) мин при температуре (15 - 25) °С, затем раствор вытряхивают или удаляют насосом.
Будьте внимательны! Стрипы могут выпадать из рамки-держателя.
Связывание IgM-антител. Одну из лунок (А1) оставляют незаполненной (контроль субстрата), другую (В2) оставить незаполненной для контроля конъюгата. Затем в две лунки вносят по 100 мкл положительного контроля (К⁺), в две другие - по 100 мкл отрицательного контроля (К^-). Во все остальные лунки вносят по 95 мкл синего раствора РИП и по 5 мкл предварительно, в 20 раз, разведенных на РИП исследуемых сывороток. (см. п. 5 "Подготовка реагентов"). Таким образом, исследуемая сыворотка в лунке разбавляется, в конечном счёте, в 400 раз. Планшет закрывают крышкой или помещают в полиэтиленовый пакет и инкубируют в течение 1 ч при температуре (37 ± 1) °С. После инкубации лунки промывают трехкратно раствором ФСРТ.
Связывание конъюгата. Во все лунки кроме А1 вносят по 100 мкл рабочего раствора конъюгата. Планшет закрывают крышкой или помещают во влажный полиэтиленовый пакет и инкубируют при температуре (37 ± 1) °С в течение 1 ч во влажной камере.
После инкубации лунки промывают пятикратно раствором ФСРТ.
Проведение ферментативной реакции. Во все лунки вносят по 100 мкл субстратного раствора. Планшет закрывают крышкой и выдерживают в темноте при температуре (15 - 25) °С в течение (20 ± 1) мин.
Остановка ферментативной реакции. Реакцию останавливают внесением в каждую лунку по 50 мкл раствора серной кислоты.

Учет и интерпретация результатов

При правильном проведении всех стадий анализа содержимое лунок с контролем субстрата и К^- должно оставаться бесцветным или бледно-желтым, а содержимое лунок с К⁺ должно приобрести желтую окраску.

Визуальный учет

Исследуемый образец оценивается как положительный, если имеются отчетливые различия в интенсивности его окрашивания по сравнению с растворами в лунках с контролем субстрата и К^-.

Инструментальный учет

Измерение оптической плотности (ОП) проводится при длине волны 490 нм непосредственно в лунках планшета с помощью вертикального фотометра. В качестве кюветы сравнения служит лунка А1 с контролем субстрата. При правильном проведении анализа среднее значение в лунках с К⁺ должно быть не менее 1,10 ± 1,5 единиц ОП, а в лунках с К^- - не должно превышать 0,15 ± 0,05 единиц ОП.

Оценка результатов производится следующим образом: если отношение среднего значения ОП (ОП_сред) исследуемой сыворотки к ОП_сред К^- ≥ 3 и при этом ОП_сред исследуемой сыворотки имеет значение выше 0,50 единиц, то этот результат следует оценивать как положительный, если отношение ОП_сред исследуемой сыворотки к ОП_сред К^- ≤ 3 или ОП_сред исследованной сыворотки ≤ 0,5, то этот результат следует оценивать как отрицательный.

Форма выпуска

Тест-систему иммуноферментную для выявления антител класса IgM к лептоспирам серологических групп Icterohaemorrhagiae и Canicola выпускают в виде комплекта, упакованного в коробку. Один комплект рассчитан на проведение от 1 до 96 анализов, включая контроли.

Условия хранения и транспортировки

Комплект тест-системы иммуноферментной для выявления антител класса IgM к лептоспирам серологических групп Icterohaemorrhagiae и Canicola хранить при температуре (4 - 6) °С. Транспортировку осуществлять всеми видами крытого транспорта при температуре не выше 25 °С не более 2 недель.
Срок годности тест-системы иммуноферментной для выявления антител класса IgM к лептоспирам серологических групп Icterohaemorrhagiae и Canicola - 6 месяцев со дня выпуска.
При нарушении условий хранения, транспортировки и схемы постановки ИФА рекламации не принимаются.