Тест-система иммуноферментная для выявления антител класса IgM к лептоспирам серологических групп Icterohaemorrhagiae и Canicola ИФА-анти-ЛЕП-IgM

(ТУ 022-01967164-2015)

Биологические и иммунологические свойства

Тест-система обладает способностью выявлять IgM-антитела к лептоспирам серологических групп Icterohaemorrhagiae и Canicola в сыворотках крови больных на сравнительно ранних сроках болезни за счет их связывания со специфическими антигенами, сорбированными на поверхности лунок стрипов. Образующийся комплекс антиген-антитело выявляется с помощью пероксидазного коньюгата на основе моноклональных антител к тяжелой цепи IgМ человека по появлению желто-коричневого окрашивания на этапе ферментативного превращения субстратного раствора.

Несмотря на то, что входящие в тест-систему контрольные сыворотки (К+, К-) инактивированы, с системой следует обращаться как с потенциально инфекционным материалом:

• работать в резиновых перчатках;
• не пипетировать ртом;
• все использованные материалы подвергать обработке дезинфицирующими растворами (6%-ным раствором перекиси водорода или монохлорамина);
• использованные наконечники обрабатывать 20 % раствором этилового спирта.

Назначение

Тест-система предназначена для серологической диагностики лептоспироза. Может быть использована при проведении текущей и ретроспективной диагностики лептоспироза при эпидемиологических исследованиях.

Состав набора

1. Восьмилуночные стрипы, сорбированные Леп-антигеном, (Леп-антиген) - 12 шт.
2. Сыворотка, содержащая IgM антитела к лептоспирам, (К+), 1,2 мл, (красный раствор) - 1 пр.
3. Сыворотка, не содержащая IgM антител к лептоспирам, (К-), 1,2 мл, (зеленый раствор) - 1 пр.
4. Концентрат конъюгата — моноклональные IgМ-антитела, меченные пероксидазой хрена, (Концентрат конъюгата), 0,2 мл, (синий раствор) - 1 пр.
5. Концентрат фосфатно-солевого буферного раствора, содержащий детергент, (ФСРТ), 20,0 мл, (бесцветный раствор) - 1 фл.
6. Раствор для исследуемых проб, (РИП), 10,0 мл - 2 фл.
7. Цитратный буферный раствор с перекисью водорода, (ЦБП), 10,0 мл - 1 фл.
8. Раствор для разведения конъюгата, (РРК), 10,0 мл - 1 фл.
9. Раствор тетраметилбензидина, (ТМБ), (бесцветный или слегка голубоватый раствор), 2,5 мл - 1 фл.
10. Раствор серной кислоты, (Стоп реагент), 5,0 мл, (бесцветный раствор) - 1 фл.
11. Полиэтиленовый пакет с молнией - 1 шт.
12. Инструкция по применению - 1 шт.

Подготовка реагентов

1. Все растворы и реагенты необходимо выдержать перед началом работы при температуре (15 — 25) ^oС в течение 30 мин. Иммуноферментный анализ (ИФА) рекомендуется проводить с использованием новых, не подвергавшихся обработке наконечников для пипеток.
2. В зависимости от числа исследуемых проб отбирают необходимое количество стрипов (полосок по 8 лунок в каждой). Остальные стрипы вынимают из рамки-держателя и хранят в закрытом полиэтиленовом мешке с молнией.
3. Растворы каждого компонента тест-системы и каждого исследуемого образца необходимо брать с помощью индивидуального наконечника для пипеток.
4. Раствор ФСРТ. Для получения рабочего раствора  содержимое  флакона с концентратом ФСРТ доводят до 500 мл дистиллированной водой.  Раствор хранят до 4 мес. при температуре (4 — 6) ^oС.
5. Исследуемые сыворотки. Для получения необходимого (1 : 400) разведения следует произвести предварительное разведение, смешав 95 мкл СИНЕГО раствора РИП с 5 мкл исследуемой сыворотки с (разведение – 1 : 20), используя дополнительный неразборный планшет; при этом цвет раствора изменится от синего до изумрудного. Разведённую сыворотку не хранить.
6. Раствор конъюгата. Концентрат конъюгата разводят на растворе РРК 1 : 80. Необходимый объем раствора конъюгата определяется числом используемых стрипов (см. пример 1). Хранят до 4 ч при температуре (4 — 6) ^oС.
7. Субстратный раствор. Готовят перед проведением ферментативной реакции. Необходимый объем раствора субстрата определяется числом используемых стрипов (см. пример 1). Хранению не подлежит.

Пример 1. Таблица расхода компонентов тест-системы.

Проведение иммуноферментного анализа

Для выявления антител к антигенам лептоспир возможно использование сыворотки крови людей как свежей, так и хранившейся при  2 – 10 °С не более 48 часов после забора крови, либо замороженной и хранившейся (исключить промежуточное оттаивание) при минус 20 °С не более 6 месяцев.

1. Гидратация сорбированного ЛЕП-антигена. Во все лунки стрипов вносят по 200 мкл раствора ФСРТ. Инкубируют в течение (1 — 2) мин. при температуре (15 — 25) ^oС, затем раствор вытряхивают или удаляют насосом. БУДЬТЕ ВНИМАТЕЛЬНЫ! Стрипы могут выпадать из рамки-держателя.
2. СВЯЗЫВАНИЕ IgM-антител. Одну из лунок (А1) оставляют незаполненной (контроль субстрата), другую (В2) оставить незаполненной для контроля конъюгата.. Затем в две лунки вносят по 100 мкл положительного контроля (К+),в две другие –– по 100 мкл отрицательного контроля (К-). Во все остальные лунки вносят по 95 мкл СИНЕГО раствора РИП и по 5 мкл предварительно, в 20 раз, разведенных на РИП исследуемых сывороток. (см. п. 5 «Подготовка реагентов») Таким образом, исследуемая сыворотка в лунке разбавляется, в конечном счёте, в 400 раз. Планшет закрывают крышкой или помещают в полиэтиленовый пакет и инкубируют в течение 1 ч при температуре (37 ± 1) °С. После инкубации лунки промывают 3-х кратно раствором ФСРТ.
3. СВЯЗЫВАНИЕ КОНЪЮГАТА. Во все лунки, КРОМЕ А1, вносят по 100 мкл рабочего раствора конъюгата. Планшет закрывают крышкой или помещают во влажный полиэтиленовый пакет и инкубируют при температуре (37 ± 1) ^oС в течение 1 ч во ВЛАЖНОЙ КАМЕРЕ. После инкубации лунки промывают 5-и  кратно раствором ФСРТ.
4. ПРОВЕДЕНИЕ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ РЕАКЦИИ. Во все лунки вносят по 100 мкл субстратного раствора. Планшет закрывают крышкой и выдерживают в темноте при температуре (15 — 25) ^oС в течение (20 ± 1) мин.
5. ОСТАНОВКА ФЕРМЕНТАТИВНОЙ РЕАКЦИИ. Реакцию останавливают внесением в каждую лунку по 50 мкл раствора серной кислоты.

Учет и интерпретация результатов ИФА

При правильном проведении всех стадий анализа содержимое лунок с контролем субстрата и К- должно оставаться  БЕСЦВЕТНЫМ  или БЛЕДНО-ЖЕЛТЫМ, а содержимое лунок с К+ должно приобрести ЖЕЛТУЮ окраску.

Визуальный учет

Исследуемый образец оценивается как положительный, если имеются отчетливые различия в интенсивности его окрашивания по сравнению с растворами в лунках с контролем субстрата, и К-.

Инструментальный учет

Измерение оптической плотности (ОП) проводится при длине волны 450 нм непосредственно в лунках планшета с помощью вертикального фотометра. В качестве кюветы сравнения служит лунка А1 с контролем субстрата. При правильном проведении анализа среднее значение в лунках с К+ должно быть не менее (0,7 ± 0,10) единиц ОП, а в лунках с К- – не должно превышать (0,15 ± 0,05) единиц ОП.

Оценка  результатов производится следующим образом: если отношение   среднего значения ОП (ОП_сред) исследуемой сыворотки к ОП_сред К- ≥ 3 и при этом ОП_сред исследуемой сыворотки имеет значение выше 0,50 единиц, то этот результат следует оценивать как положительный, если отношение ОП_сред исследуемой сыворотки к ОП_сред К- ≤ 3 или ОП_сред исследованной сыворотки ≤ 0,5, то этот результат следует оценивать как отрицательный.

Форма выпуска

Тест-систему выпускают в виде комплекта,  упакованного в коробку. Один комплект рассчитан на проведение от 1 до 96 анализов, включая контроли.

Условия хранения и транспортировки

Комплект тест-системы   хранить  при  температуре  (4 — 6) ^oС. Транспортировку осуществлять всеми видами крытого транспорта  при температуре не выше 25 ^оС не более 2-х недель.

Срок годности тест-системы — 6 месяцев со дня выпуска.

При нарушении условий хранения, транспортировки и схемы постановки ИФА рекламации не принимаются.

В остальных случаях рекламации на качество тест-системы направляются по адресу учреждения изготовителя:  197101, С. Петербург, ул. Мира, д.14, ОНТ, телефакс (812) 233-17-03, тел. (812) 325-27-10, E-mail: pasteurdnt@yandex.ru. © НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера, 1997.