Тест-система иммуноферментная для выявления антигенов коксиелл Бернета ИФА-Ку-АНТИГЕН (комплект 1)

Биологические и иммунологические свойства

Тест-система обладает способностью выявлять антигены коксиелл Бернета (Ку-антиген)  за счет их связывания с поликлональными антителами, сорбированными на поверхности лунок стрипов. Образующийся комплекс антитело-антиген выявляется с помощью пероксидазного коньюгата на основе поликлональных антител по появлению желтого окрашивания на этапе ферментативного превращения субстратного раствора.

Несмотря на то, что входящие в тест-систему контрольные образцы (К+ и К-) инактивированы, с системой следует обращаться как с потенциально инфекционным материалом:

  • работать в резиновых перчатках;
  • не пипетировать ртом;
  • все использованные материалы подвергать обработке дезинфицирующими растворами (6 % раствором перекиси водорода или монохлорамина);
  • использованные наконечники обрабатывать 20 % раствором этилового спирта.

Назначение

Тест-система предназначена для выявления Ку-антигена в объектах внешней среды, (смывы) и материалах биологического происхождения (органы животных, клещи).

Состав набора

  1. 8-луночные стрипы, сорбированные антителами к Ку-антигену - 12 шт.
  2. Позитивный контрольный образец, содержащий антиген коксиелл Бернета, (К+), (красный раствор), 1,2 мл - 1 пр.
  3. Негативный контрольный образец, содержащий гетерологический антиген, (К-), (зеленый раствор), 1,2 мл - 1 пр.
  4. Конъюгат — поликлональные антитела к коксиеллам Бернета, меченные пероксидазой хрена, (Концентрат конъюгата), (синий раствор), 0,2 мл - 1 пр.
  5. Концентрат фосфатно-солевого буферного раствора, содержащий детергент — твин-80, (ФСРТ), (бесцветный раствор), 20,0 мл - 1 фл.
  6. Цитратный буферный раствор с перекисью водорода, (ЦБП), (бесцветный раствор), 10,0 мл - 1 фл.
  7. Раствор для разведения конъюгата, (РРК), (бесцветный раствор), 10,0 мл - 1 фл.
  8. Раствор тетраметилбензидина, (ТМБ), (бесцветный или слегка голубоватый раствор), 2,5 мл - 1 фл.
  9. Раствор серной кислоты, (Стоп реагент), (бесцветный раствор), 5,0 мл - 1 фл.
  10. Полиэтиленовый пакет с молнией - 1 шт.
  11. Инструкция по применению - 1 шт.

Подготовка реагентов

  1. Все растворы и реагенты необходимо выдержать перед началом работы при температуре (18 — 25) oС в течение 30 мин. Иммуноферментный анализ (ИФА) рекомендуется проводить с использованием новых, не подвергавшихся обработке наконечников для пипеток.
  2. Растворы каждого компонента тест-системы и каждого исследуемого образца необходимо брать с помощью индивидуального наконечника для пипеток.
  3. В зависимости от числа исследуемых проб отбирают необходимое количество стрипов. Остальные стрипы вынимают из рамки-держателя и хранят в закрытом полиэтиленовом пакете с молнией при температуре (4 — 6) °С.
  4. Материал для исследования. а) Внутренние органы животных, клещей растирают в стерильной фарфоровой ступке и готовят 25 % суспензию в 0,9 % растворе хлорида натрия. Полученную суспензию подвергают трехкратной процедуре замораживания-оттаивания, инактивируют в водяной бане при температуре 100 °С в течение 20 мин. и центрифугируют при 1000 об./мин. в течение 15 мин. Дальнейшее исследование проводят с супернатантом. б) Смывы берут ватным тампоном, смоченным 0,9 % раствором хлорида натрия, с поверхности не менее 200 –– 300 см2. Тампон помещают в пробирку, содержащую 2 –– 5 мл 0,9 % раствора хлорида натрия. Перед исследованием тампон тщательно отжимают, содержимое пробирки инактивируют на водяной бане при температуре 100 °С в течение 20 мин.
  5. Раствор ФСРТ. Для получения рабочего раствора  содержимое  флакона с концентратом ФСРТ доводят до 500 мл дистиллированной водой.  Раствор хранят до 4 мес. при температуре (4 — 6) oС.
  6. Раствор конъюгата. Концентрат конъюгата разводят на растворе РРК 1 : 80. Необходимый объем раствора конъюгата определяется числом используемых стрипов (см. пример 1). Хранят до 4 ч при температуре (4 — 6) oС.
  7. Субстратный раствор. Готовят перед проведением ферментативной реакции. Необходимый объем раствора субстрата определяется числом используемых стрипов (см. пример 1). Хранению не подлежит.

Пример № 1. Таблица расхода компонентов тест-системы.

Количество одновременно используемых стрипов Коньюгат (мкл) Разводящий буфер для коньюгата (РРК) (мл) ТМБ (мл) ЦБП (мл)
1 15 1,2 0,2 0,8
2 30 2,4 0,4 1,6
3 40 3,2 0,6 2,4
4 50 4,0 0,8 3,2
5 60 4,8 1,0 4,0
6 70 5,6 1,2 4,8
7 80 6,4 1,4 5,6
8 90 7,2 1,6 6,4
9 100 8,0 1,8 7,2
10 110 8,8 2,0 8,0
11 120 9,6 2,2 8,8
12 130 10,4 2,4 9,6

Обработка исследуемого материала до инактивации возбудителя требует соблюдения инструкций, изложенных в сборнике санитарных и ветеринарных правил «Профилактика и борьба с заразными болезнями, общими для человека и животных» (Москва, 1996).

Проведение иммуноферментного анализа

  1. Гидратация сорбированных антител к Ку-антигену. Во все лунки стрипов внести по 200-300 мкл раствора ФСРТ. Инкубировать в течение (1–2) мин. при температуре (15 – 25) °С. Удалить содержимое лунок в ёмкость с дезинфицирующим раствором с помощью отсасывателя. БУДЬТЕ ВНИМАТЕЛЬНЫ! Стрипы могут выпадать из рамки-держателя.
  2. СВЯЗЫВАНИЕ Ку-антигена. Одну из лунок (А1) оставляют незаполненной (контроль субстрата). В две лунки вносят по 100 мкл КРАСНОГО раствора К+, в две другие лунки вносят по 100 мкл ЗЕЛЕНОГО раствора К-, в остальные лунки вносят по 100 мкл исследуемых образцов (см п. 4 «Подготовка реагентов»). Планшет закрывают крышкой или помещают в полиэтиленовый пакет и инкубируют в течение 1 ч при температуре (37 ± 1) °С. После инкубации лунки промывают 3-х кратно  раствором ФСРТ.
  3. СВЯЗЫВАНИЕ КОНЪЮГАТА. Во все лунки, КРОМЕ А1, вносят по 100 мкл рабочего раствора конъюгата. Планшет закрывают крышкой или помещают во влажный полиэтиленовый пакет и инкубируют при температуре (37 ± 1) oС в течение 1 ч. После инкубации лунки промывают 5-ти кратно раствором ФСРТ.
  4. ПРОВЕДЕНИЕ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ РЕАКЦИИ. Во все лунки вносят по 100 мкл субстратного раствора. Планшет закрывают крышкой и выдерживают в темноте при температуре (15 — 25) oС в течение (20 ± 1) мин.
  5. ОСТАНОВКА ФЕРМЕНТАТИВНОЙ РЕАКЦИИ. Реакцию останавливают внесением в каждую лунку по 50 мкл раствора серной кислоты.

Учет и интерпретация результатов ИФА

При правильном проведении всех стадий анализа содержимое лунок с контролем субстрата и К- должно оставаться  БЕСЦВЕТНЫМ  или БЛЕДНО-ЖЕЛТЫМ, а содержимое лунок с К+ должно приобрести ЖЕЛТУЮ окраску.

Визуальный учет

Исследуемый образец оценивается как положительный, если имеются отчетливые различия в интенсивности его окрашивания по сравнению с растворами в лунках с контролем субстрата и К-.

Инструментальный учет

Измерение оптической плотности (ОП) проводится при длине волны 450 нм непосредственно в лунках планшета с помощью вертикального фотометра. В качестве кюветы сравнения служит лунка А1 с контролем субстрата. При правильном проведении анализа среднее значение в лунках с К+ должно быть не менее (0,60 ± 0,10) единиц ОП, а в лунках с К- – не должно превышать (0,15 ± 0,05) единиц ОП.

Оценка результатов производится следующим образом: если отношение (А)  среднего значения ОП (ОПсред) исследуемого образца к ОПсред К- больше или равно 3 (А ≥ 3), то этот результат следует оценивать как положительный, если отношение ОПсред исследуемого образца к ОПсред К- меньше 3  (А < 3), то этот результат следует оценивать как отрицательный. Положительный результат ИФА свидетельствует о наличии антигенов коксиелл Бернета в исследуемом материале, отрицательный – о том, что данным методом антигены не обнаружены.

Пример № 2.

Образец ОП при 450 нм Среднее значение ОП при 450 нм Значение А (ОПсред / ОПсред К-)
К- 0,17 0,18  
К- 0,19
К+ 0,92 0,90  
К+ 0,88
Проба 1 0,98 0,96 0,96/0,18 = 5,3
Проба 1 0,94
Проба 2 0,24 0,22 0,22/0,18 = 1,2
Проба 2 0,20

Проба 1: А = 0,96/0,18 = 5,3 – результат следует оценивать как положительный.

Проба 2: А = 0,22/0,18 = 1,2 – результат следует оценивать как отрицательный.

Форма выпуска

Тест-систему выпускают в виде комплекта,  упакованного в коробку. Один комплект рассчитан на проведение от 1 до 96 анализов, включая контроли.

Условия хранения и транспортировки

Комплект тест-системы   хранить  при  температуре  (4 — 6) oС. Транспортировку осуществлять всеми видами крытого транспорта  при температуре не выше 25 оС не более 2 недель.

Срок годности тест-системы — 6  мес. со дня выпуска.

При нарушении условий хранения, транспортировки и схемы постановки ИФА рекламации не принимаются.

В остальных случаях рекламации на качество тест-системы направляются по адресу учреждения изготовителя:  197101, С. Петербург, ул. Мира, д.14, ОНТ, телефакс (812) 233-17-03, тел. (812) 325-27-10, E-mail: pasteurdnt@yandex.ru.

Главная :: Список инструкций
Регистрационные удостоверения
Награды сотрудников отдела
  • Лучший доклад молодых ученых «Новые концепции механизмов воспаления, аутоиммунного ответа и развития опухоли» V Международной научно-практической конференции. Государственное бюджетное образовательное учреждение дополнительного профессионального образован
  • Диплом победителя конкурса «Лучшая работа молодого ученого» Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора «Актуальные проблемы эпидемиологии и профилактической медицины», г. Ставрополь, 22 – 24 октября 2014 г
  • Диплом «Победитель конкурса грантов Санкт-Петербурга для студентов, аспирантов, молодых ученых, молодых кандидатов наук 2014 г.»
  • Победитель Конкурса грантов Санкт-Петербурга для студентов, аспирантов, молодых ученых, молодых кандидатов наук 2010 г. Махлай Наталья Сергеевна
  • Победитель XIV Конкурса бизнес-идей, научно-технических разработок и научно-исследовательских проектов Молодые, дерзкие, перспективные. Ольга Валентиновна Заручейнова
  • Финалист XIV Конкурса бизнес-идей, научно-технических разработок и научно-исследовательских проектов Молодые, дерзкие, перспективные. Наталья Сергеевна Махлай
  • Победитель программы Участник молодежного научно-инновационного конкурса (УМНИК). Васильева Елена Викторовна. НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера
ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера
Отдел новых технологий
Факс
(812) 313-69-89
(812) 233-17-03