Тест-система иммуноферментная для выявления антигенов коксиелл Бернета ИФА-Ку-АНТИГЕН (комплект 1)
Биологические и иммунологические свойства
Тест-система обладает способностью выявлять антигены коксиелл Бернета (Ку-антиген) за счет их связывания с поликлональными антителами, сорбированными на поверхности лунок стрипов. Образующийся комплекс антитело-антиген выявляется с помощью пероксидазного коньюгата на основе поликлональных антител по появлению желтого окрашивания на этапе ферментативного превращения субстратного раствора.
Несмотря на то, что входящие в тест-систему контрольные образцы (К+ и К-) инактивированы, с системой следует обращаться как с потенциально инфекционным материалом:
- работать в резиновых перчатках;
- не пипетировать ртом;
- все использованные материалы подвергать обработке дезинфицирующими растворами (6 % раствором перекиси водорода или монохлорамина);
- использованные наконечники обрабатывать 20 % раствором этилового спирта.
Назначение
Тест-система предназначена для выявления Ку-антигена в объектах внешней среды, (смывы) и материалах биологического происхождения (органы животных, клещи).
Состав набора
- 8-луночные стрипы, сорбированные антителами к Ку-антигену - 12 шт.
- Позитивный контрольный образец, содержащий антиген коксиелл Бернета, (К+), (красный раствор), 1,2 мл - 1 пр.
- Негативный контрольный образец, содержащий гетерологический антиген, (К-), (зеленый раствор), 1,2 мл - 1 пр.
- Конъюгат — поликлональные антитела к коксиеллам Бернета, меченные пероксидазой хрена, (Концентрат конъюгата), (синий раствор), 0,2 мл - 1 пр.
- Концентрат фосфатно-солевого буферного раствора, содержащий детергент — твин-80, (ФСРТ), (бесцветный раствор), 20,0 мл - 1 фл.
- Цитратный буферный раствор с перекисью водорода, (ЦБП), (бесцветный раствор), 10,0 мл - 1 фл.
- Раствор для разведения конъюгата, (РРК), (бесцветный раствор), 10,0 мл - 1 фл.
- Раствор тетраметилбензидина, (ТМБ), (бесцветный или слегка голубоватый раствор), 2,5 мл - 1 фл.
- Раствор серной кислоты, (Стоп реагент), (бесцветный раствор), 5,0 мл - 1 фл.
- Полиэтиленовый пакет с молнией - 1 шт.
- Инструкция по применению - 1 шт.
Подготовка реагентов
- Все растворы и реагенты необходимо выдержать перед началом работы при температуре (18 — 25) oС в течение 30 мин. Иммуноферментный анализ (ИФА) рекомендуется проводить с использованием новых, не подвергавшихся обработке наконечников для пипеток.
- Растворы каждого компонента тест-системы и каждого исследуемого образца необходимо брать с помощью индивидуального наконечника для пипеток.
- В зависимости от числа исследуемых проб отбирают необходимое количество стрипов. Остальные стрипы вынимают из рамки-держателя и хранят в закрытом полиэтиленовом пакете с молнией при температуре (4 — 6) °С.
- Материал для исследования. а) Внутренние органы животных, клещей растирают в стерильной фарфоровой ступке и готовят 25 % суспензию в 0,9 % растворе хлорида натрия. Полученную суспензию подвергают трехкратной процедуре замораживания-оттаивания, инактивируют в водяной бане при температуре 100 °С в течение 20 мин. и центрифугируют при 1000 об./мин. в течение 15 мин. Дальнейшее исследование проводят с супернатантом. б) Смывы берут ватным тампоном, смоченным 0,9 % раствором хлорида натрия, с поверхности не менее 200 –– 300 см2. Тампон помещают в пробирку, содержащую 2 –– 5 мл 0,9 % раствора хлорида натрия. Перед исследованием тампон тщательно отжимают, содержимое пробирки инактивируют на водяной бане при температуре 100 °С в течение 20 мин.
- Раствор ФСРТ. Для получения рабочего раствора содержимое флакона с концентратом ФСРТ доводят до 500 мл дистиллированной водой. Раствор хранят до 4 мес. при температуре (4 — 6) oС.
- Раствор конъюгата. Концентрат конъюгата разводят на растворе РРК 1 : 80. Необходимый объем раствора конъюгата определяется числом используемых стрипов (см. пример 1). Хранят до 4 ч при температуре (4 — 6) oС.
- Субстратный раствор. Готовят перед проведением ферментативной реакции. Необходимый объем раствора субстрата определяется числом используемых стрипов (см. пример 1). Хранению не подлежит.
Пример № 1. Таблица расхода компонентов тест-системы.
Количество одновременно используемых стрипов | Коньюгат (мкл) | Разводящий буфер для коньюгата (РРК) (мл) | ТМБ (мл) | ЦБП (мл) |
---|---|---|---|---|
1 | 15 | 1,2 | 0,2 | 0,8 |
2 | 30 | 2,4 | 0,4 | 1,6 |
3 | 40 | 3,2 | 0,6 | 2,4 |
4 | 50 | 4,0 | 0,8 | 3,2 |
5 | 60 | 4,8 | 1,0 | 4,0 |
6 | 70 | 5,6 | 1,2 | 4,8 |
7 | 80 | 6,4 | 1,4 | 5,6 |
8 | 90 | 7,2 | 1,6 | 6,4 |
9 | 100 | 8,0 | 1,8 | 7,2 |
10 | 110 | 8,8 | 2,0 | 8,0 |
11 | 120 | 9,6 | 2,2 | 8,8 |
12 | 130 | 10,4 | 2,4 | 9,6 |
Обработка исследуемого материала до инактивации возбудителя требует соблюдения инструкций, изложенных в сборнике санитарных и ветеринарных правил «Профилактика и борьба с заразными болезнями, общими для человека и животных» (Москва, 1996).
Проведение иммуноферментного анализа
- Гидратация сорбированных антител к Ку-антигену. Во все лунки стрипов внести по 200-300 мкл раствора ФСРТ. Инкубировать в течение (1–2) мин. при температуре (15 – 25) °С. Удалить содержимое лунок в ёмкость с дезинфицирующим раствором с помощью отсасывателя. БУДЬТЕ ВНИМАТЕЛЬНЫ! Стрипы могут выпадать из рамки-держателя.
- СВЯЗЫВАНИЕ Ку-антигена. Одну из лунок (А1) оставляют незаполненной (контроль субстрата). В две лунки вносят по 100 мкл КРАСНОГО раствора К+, в две другие лунки вносят по 100 мкл ЗЕЛЕНОГО раствора К-, в остальные лунки вносят по 100 мкл исследуемых образцов (см п. 4 «Подготовка реагентов»). Планшет закрывают крышкой или помещают в полиэтиленовый пакет и инкубируют в течение 1 ч при температуре (37 ± 1) °С. После инкубации лунки промывают 3-х кратно раствором ФСРТ.
- СВЯЗЫВАНИЕ КОНЪЮГАТА. Во все лунки, КРОМЕ А1, вносят по 100 мкл рабочего раствора конъюгата. Планшет закрывают крышкой или помещают во влажный полиэтиленовый пакет и инкубируют при температуре (37 ± 1) oС в течение 1 ч. После инкубации лунки промывают 5-ти кратно раствором ФСРТ.
- ПРОВЕДЕНИЕ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ РЕАКЦИИ. Во все лунки вносят по 100 мкл субстратного раствора. Планшет закрывают крышкой и выдерживают в темноте при температуре (15 — 25) oС в течение (20 ± 1) мин.
- ОСТАНОВКА ФЕРМЕНТАТИВНОЙ РЕАКЦИИ. Реакцию останавливают внесением в каждую лунку по 50 мкл раствора серной кислоты.
Учет и интерпретация результатов ИФА
При правильном проведении всех стадий анализа содержимое лунок с контролем субстрата и К- должно оставаться БЕСЦВЕТНЫМ или БЛЕДНО-ЖЕЛТЫМ, а содержимое лунок с К+ должно приобрести ЖЕЛТУЮ окраску.
Визуальный учет
Исследуемый образец оценивается как положительный, если имеются отчетливые различия в интенсивности его окрашивания по сравнению с растворами в лунках с контролем субстрата и К-.
Инструментальный учет
Измерение оптической плотности (ОП) проводится при длине волны 450 нм непосредственно в лунках планшета с помощью вертикального фотометра. В качестве кюветы сравнения служит лунка А1 с контролем субстрата. При правильном проведении анализа среднее значение в лунках с К+ должно быть не менее (0,60 ± 0,10) единиц ОП, а в лунках с К- – не должно превышать (0,15 ± 0,05) единиц ОП.
Оценка результатов производится следующим образом: если отношение (А) среднего значения ОП (ОПсред) исследуемого образца к ОПсред К- больше или равно 3 (А ≥ 3), то этот результат следует оценивать как положительный, если отношение ОПсред исследуемого образца к ОПсред К- меньше 3 (А < 3), то этот результат следует оценивать как отрицательный. Положительный результат ИФА свидетельствует о наличии антигенов коксиелл Бернета в исследуемом материале, отрицательный – о том, что данным методом антигены не обнаружены.
Пример № 2.
Образец | ОП при 450 нм | Среднее значение ОП при 450 нм | Значение А (ОПсред / ОПсред К-) |
---|---|---|---|
К- | 0,17 | 0,18 | |
К- | 0,19 | ||
К+ | 0,92 | 0,90 | |
К+ | 0,88 | ||
Проба 1 | 0,98 | 0,96 | 0,96/0,18 = 5,3 |
Проба 1 | 0,94 | ||
Проба 2 | 0,24 | 0,22 | 0,22/0,18 = 1,2 |
Проба 2 | 0,20 |
Проба 1: А = 0,96/0,18 = 5,3 – результат следует оценивать как положительный.
Проба 2: А = 0,22/0,18 = 1,2 – результат следует оценивать как отрицательный.
Форма выпуска
Тест-систему выпускают в виде комплекта, упакованного в коробку. Один комплект рассчитан на проведение от 1 до 96 анализов, включая контроли.
Условия хранения и транспортировки
Комплект тест-системы хранить при температуре (4 — 6) oС. Транспортировку осуществлять всеми видами крытого транспорта при температуре не выше 25 оС не более 2 недель.
Срок годности тест-системы — 6 мес. со дня выпуска.
При нарушении условий хранения, транспортировки и схемы постановки ИФА рекламации не принимаются.
В остальных случаях рекламации на качество тест-системы направляются по адресу учреждения изготовителя: 197101, С. Петербург, ул. Мира, д.14, ОНТ, телефакс (812) 233-17-03, тел. (812) 325-27-10, E-mail: pasteurdnt@yandex.ru.