Набор для выявления антигенов коксиелл Бернета

Биологические и иммунологические свойства

Тест-система иммуноферментная для выявления антигенов коксиелл Бернета обладает способностью выявлять антигены коксиелл Бернета (Ку-антиген) за счет их связывания с поликлональными антителами, сорбируемыми на поверхности лунок стрипов. Образующийся комплекс антитело-антиген выявляется с помощью пероксидазного коньюгата на основе поликлональных антител по появлению желтого окрашивания на этапе ферментативного превращения субстратного раствора.

Несмотря на то, что входящие в тест-систему иммуноферментную для выявления антигенов коксиелл Бернета контрольные образцы (К⁺ и К^-) инактивированы, с системой следует обращаться как с потенциально инфекционным материалом:

работать в резиновых перчатках;
не пипетировать ртом;
все использованные материалы подвергать обработке дезинфицирующими растворами (6 % раствором перекиси водорода или монохлорамина);
использованные наконечники обрабатывать 20 % раствором этилового спирта.

Назначение

Тест-система иммуноферментная для выявления антигенов коксиелл Бернета предназначена для выявления Ку-антигена в объектах внешней среды (в смывах со шкур коров, коз и овец) и материалах биологического происхождения (в органах животных, клещах и т. д.). Кроме того данная тест-система может использоваться для стандартизации антигенов и вакцин, приготовленных из коксиелл Бернета.

Состав набора

Восьмилуночные стрипы - 12 шт.
Концентрат анти-Ку антител для сорбции, (Концентрат анти-Ку), 0,6 мл, (бесцветный раствор) - 1 пр.
Позитивный контрольный образец, содержащий антиген коксиелл Бернета, (К⁺), 1,2 мл, (красный раствор) - 1 пр.
Негативный контрольный образец, содержащий гетерологический антиген, (К^-), 1,2 мл, (зеленый раствор) - 1 пр.
Конъюгат - поликлональные антитела к коксиеллам Бернета, меченные пероксидазой хрена, (Концентрат конъюгата), 0,2 мл, (синий раствор) - 1 пр.
Физиологический раствор (ФР), 10,0 мл, (голубой раствор) - 1 фл.
Концентрат фосфатно-солевого буферного раствора, содержащий детергент-твин-80 (ФСРТ), 20,0 мл, (бесцветный раствор) - 1 фл.
Цитратный буферный раствор с перекисью водорода (ЦБП), 10,0 мл - 1 фл.
Раствор для разведения конъюгата (РРК), 10,0 мл - 1 фл.
Раствор тетраметилбензидина (ТМБ), (бесцветный или слегка голубоватый раствор), 2,5 мл - 1 фл.
Раствор серной кислоты, (Стоп реагент), 5,0 мл, (бесцветный раствор) - 1 фл.
Полиэтиленовый пакет с молнией - 1 шт.
Инструкция по применению - 1 шт.

Подготовка реагентов

Все растворы и реагенты необходимо выдержать перед началом работы при температуре (15 - 25) °С в течение 30 мин. Иммуноферментный анализ (ИФА) рекомендуется проводить с использованием новых, не подвергавшихся обработке наконечников для пипеток.
В зависимости от числа исследуемых проб отбирают необходимое количество стрипов (полосок по 8 лунок в каждой). Остальные стрипы вынимают из рамки-держателя и хранят в закрытом полиэтиленовом пакете с молнией при температуре (4 - 6) °С.
Растворы каждого компонента тест-системы иммуноферментной для выявления антигенов коксиелл Бернета и каждого исследуемого образца необходимо брать с помощью индивидуального наконечника для пипеток.
Материал для исследования^*
а) внутренние органы животных, клещей растирают в стерильной фарфоровой ступке и готовят 25 % суспензию в 0,9 % растворе хлорида натрия. Полученную суспензию подвергают трехкратной процедуре замораживания-оттаивания, инактивируют в водяной бане при температуре 100 °С в течение 20 мин и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 15 мин. Дальнейшее исследование проводят с супернатантом;
б) смывы берут ватным тампоном, смоченном в 0,9 % растворе хлорида натрия, с поверхности не менее 200 - 300 см², тампон помещают в стерильную пробирку, содержащую 2 - 5 мл 0,9 % раствора хлорида натрия. Перед исследованием тампон тщательно отмывают, содержимое пробирки инактивируют на водяной бане при температуре 100 °С в течение 20 мин и исследуют.
^*Обработка исследуемого материала до инактивации возбудителя требует соблюдения инструкций изложенных в сборнике санитарных и ветеринарных правил "Профилактика и борьба с заразными болезнями, общими для человека и животных" (Москва, 1996).
Раствор ФСРТ. Для получения рабочего раствора содержимое флакона с концентратом ФСРТ доводят до 500 мл дистиллированной водой. Раствор хранят до 4 мес при температуре (4 - 6) °С.
Раствор анти-Ку для сорбции. Для получения рабочего раствора анти-Ку для сорбции концентрат анти-Ку разводят 1:20 на растворе ФР. Необходимый объем раствора анти-Ку определяется числом используемых стрипов (см. пример 1). Хранят до 4 ч при температуре (4 - 6) °С.
Раствор конъюгата. Концентрат конъюгата разводят на растворе РРК 1:80. Необходимый объем раствора конъюгата определяется числом используемых стрипов (см. пример 1). Хранят до 4 ч при температуре (4 - 6) °С.
Субстратный раствор. Готовят перед проведением ферментативной реакции. Необходимый объем раствора субстрата определяется числом используемых стрипов (см. пример 1). Хранению не подлежит.
Пример 1. Таблица расхода компонентов тест-системы иммуноферментной для выявления антигенов коксиелл Бернета

Проведение иммуноферментного анализа

Сорбция анти-Ку. Во все лунки стрипов вносят по 100 мкл раствора анти-Ку. Планшет закрывают крышкой или помещают во влажный полиэтиленовый пакет и инкубируют в течение (12 - 24) ч при температуре (15 - 25) °С. Затем раствор вытряхивают или удаляют с помощью отсасывателя и промывают 2 раза раствором ФСРТ, внося в каждую лунку по (200 - 300) мкл раствора с последующим удалением.
Будьте внимательны! Стрипы могут выпадать из рамки-держателя.
Связывание Ку-антигена. Одну из лунок (А1) оставляют незаполненной (контроль субстрата). В две лунки вносят по 100 мкл красного раствора К⁺, в две другие лунки вносят по 100 мкл зеленого раствора К^-, в остальные лунки вносят по 100 мкл исследуемых образцов (см п. 4 "Подготовка реагентов"). Планшет закрывают крышкой или помещают в полиэтиленовый пакет и инкубируют в течение 1 ч при температуре (37 ± 1) °С. После инкубации лунки промывают трехкратно раствором ФСРТ.
Связывание конъюгата. Во все лунки, кроме А1, вносят по 100 мкл рабочего раствора конъюгата. Планшет закрывают крышкой или помещают во влажный полиэтиленовый пакет и инкубируют при температуре (37 ± 1) °С в течение 1 ч.
После инкубации лунки промывают пятикратно раствором ФСРТ.
Проведение ферментативной реакции. Во все лунки вносят по 100 мкл субстратного раствора. Планшет закрывают крышкой и выдерживают в темноте при температуре (15 - 25) °С в течение (20 ± 1) мин.
Остановка ферментативной реакции. Реакцию останавливают внесением в каждую лунку по 50 мкл раствора серной кислоты.

Учет и интерпретация результатов

При правильном проведении всех стадий анализа содержимое лунок с контролем субстрата и К^- должно оставаться бесцветным или бледно-желтым, а содержимое лунок с К⁺ должно приобрести желтую окраску.

Визуальный учет

Исследуемый образец оценивается как положительный, если имеются отчетливые различия в интенсивности его окрашивания по сравнению с растворами в лунках с контролем субстрата и К^-.

Инструментальный учет

Измерение оптической плотности (ОП) проводится при длине волны 450 нм непосредственно в лунках планшета с помощью вертикального фотометра. В качестве кюветы сравнения служит лунка А1 с контролем субстрата. При правильном проведении анализа среднее значение в лунках с К⁺ должно быть не менее 0,80 ± 0,10 единиц ОП, а в лунках с К^- - не должно превышать 0,15 ± 0,05 единиц ОП.

Оценка результатов производится следующим образом: если отношение среднего значения ОП (ОП_сред) исследуемого образца к ОП_сред К^- ≥ 3 и при этом ОП_сред исследуемого образца имеет значение выше 0,50 единиц, то этот результат следует оценивать как положительный, если отношение ОП_сред исследуемого образца к ОП_сред К^- < 3 или ОП_сред исследуемого образца < 0,5, то этот результат следует оценивать как отрицательный. Положительный результат ИФА свидетельствует о наличии антигена коксиелл Бернета в исследуемом материале, отрицательный - о том, что данным методом антиген не обнаружен.

Пример 2.

Проба 1: ОП_сред=0,96 - результат следует оценивать как положительный.
Проба 2: ОП_сред=0,22 - результат следует оценивать как отрицательный.
Проба 3: ОП_сред=0,54, то есть ОП_сред исследованной сыворотки равно 3 ОП_сред К^-, и при этом ОП_сред исследуемой сыворотки имеет значение выше 0,50 единиц, этот результат следует оценивать как положительный.

Форма выпуска

Тест-систему иммуноферментную для выявления антигенов коксиелл Бернета выпускают в виде комплекта, упакованного в коробку. Один комплект рассчитан на проведение от 1 до 96 анализов, включая контроли.

Условия хранения и транспортировки

Комплект тест-системы иммуноферментной для выявления антигенов коксиелл Бернета хранить при температуре (4 - 6) °С. Транспортировку осуществлять всеми видами крытого транспорта при температуре не выше 25 °С не более 2 недель.
Срок годности тест-системы иммуноферментной для выявления антигенов коксиелл Бернета - 6 месяцев со дня выпуска.
При нарушении условий хранения, транспортировки и схемы постановки ИФА рекламации не принимаются.