Устранение перекрестно реагирующих антигенов

После каждого этапа инкубации специфического реагента с твердой фазой устанавливается динамическое равновесие иммуносорбент - специфический реагент, положение которого зависит от величины константы равновесия. Добавление каждой новой порции промывного раствора вызывает установление этого равновесия заново. В результате количество удаляемого специфического реагента будет определяться величиной К и числом промывок. Рассмотрим, как влияют эти величины на степень насыщения специфическим реагентом иммуносорбента на модели взаимодействия одновалентного антигена и одновалентного антитела.

Пусть поверхностная концентрация первого специфического реагента в лунке полистиролового планшета составляет 1,5 нг/мм², что соответствует 10^-7 М [12], а первоначальная степень насыщения иммуносорбента после стадии инкубации равна 90 %. В этом случае начальная концентрация специфического комплекса на твердой фазе равна 0,9х10^-7М

Рис. Влияние числа промывок на диссоциацию специфического комплекса в зависимости от величины К. По оси абсцисс - число промывок, по оси ординат - процент связывания.

После установления равновесия в результате первой промывки концентрация комплекса составит (0.9х10^-7 - х), а концентрация свободного антигена и ставших свободными антител будет равна х. Тогда уравнение (3-2) примет вид:

Найдем значения х:

Подставив в это уравнение различные значения К = 10⁶, 10⁷, 10⁸,10⁹, М^-1, получим следующие значения = 0,83х10^-7, 0,57х10^-7, 0,25х10^-7 и 0,09х10^-7 М^-1 соответственно. Для расчета степени насыщения необходимо рассчитать соотношение:

Это составляет 7 %, 23 %, 65 %, и 81 %. Для второй промывки в уравнении (4 - 2) вместо 0,9х10^-7 следует подставить разность (0,9-х)х10^-7, где - величина десорбции после промывки. Это составляет, как показывают расчеты, 25 %, 11 %, 44 % и 72,5 % для соответствующих значений К. Графическая зависимость влияния числа промывок на степень насыщения иммуносорбента в зависимости от величины К дана на рисунке.

На основании этих модельных расчетов можно сделать следующие выводы:

перекрестно реагирующие антигены, имеющие низкие значения констант связывания, почти полностью удаляются с иммуносорбента после многократных промывок;
при образовании специфического комплекса нельзя использовать специфические реагенты с низкими значениями К;
чувствительность анализа определяется наименьшей величиной К при образовании многослойного специфического комплекса;
для получения воспроизводимых результатов необходимо стандартизовать этапы прмывки.