Материалы и методы исследования

Материалы

Реактивы, используемые для проведения электрофореза ДНК и белков в агарозном и полиакриламидном гелях производства фирмы «Sigma-Aldrich» (США). Дрожжевой экстракт, бакто-триптон, агар фирмы «Difco» (Великобритания). Ni-NTA-сефароза 6В-CL, набор для выделения ДНК из агарозного геля фирмы «Qiagen» (США). Фенол, лизоцим, хлороформ, этанол, кислоты, щелочи, соли квалификации «ХЧ» или «ОСЧ» производства «Реахим» (Россия).

Ферменты: ДНК-полимераза Phusion («Finnzymes», Финляндия), ДНК-лигаза бактериофага Т4, эндонуклеазы рестрикции фирмы «Сибэнзим» (Россия).

Штаммы Escherichia coli: BL21 (DE3) и Rosetta 2 (DE3).

Плазмидные векторные ДНК:

  • pET36b(+) («Novagen», США);
  • pETm-cbd - модифицированный нами вектор pET36b(+), в котором за нуклеотидной последовательностью целлюлозосвязывающего домена эндоглюконазы А (CBDCenA) из Cellumonas fimi следует встроенная последовательность полилинкера, включающего сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции в указанной последовательности: AgeI, EcoRI, KpnI, BssHII, BstEII, HindIII, XhoI;
  • pJExpress401-esat6-cfp10 («DNA2.0», США).

Коммерческие антигены Mtb: антиген PPDN-3, который представляет собой ультрафильтрат культур возбудителя туберкулеза штаммов DТSТ и Valee и используется в тест-системе «ИФА-анти-ТУБ», выпускаемой Отделом Новых Технологий ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера (г. Санкт-Петербург).

Биологический материал: образцы сывороток крови были получены от больных туберкулезом (БЛ) легких (n=321), проходивших стационарный этап лечения в СПБ ГУЗ ПТБ № 3 в 2011 - 2012 г. в возрасте от 18 до 76 лет (54 % мужчин, 46 % женщин), средний возраст составил 38 лет (30 для мужчин и 48 для женщин). У 71 % больных имел место инфильтративный ТБ легких, у 14 % - фиброзно-кавернозный ТБ. Оставшиеся 15 % составили больные казеозной пневмонией, очаговым ТБ, диссеминированным ТБ и туберкулемой. У 86 % больных диагноз ТБ был подтвержден микроскопией мокроты или культуральным методом (посев мокроты). 52 % составили больные с впервые выявленным ТБ, оставшиеся 48 % - с хроническим ТБ процессом. Сыворотки крови были получены также и от больных с заболеваниями легких нетуберкулезной этиологии (НЗЛ): больные саркоидозом (n=40) и пневмонией (n=28), находившихся на лечении в СПБ ГУЗ ГМПБ № 2. Для подтверждения диагноза саркоидоза у 30 % пациентов проводилась чрезбронхиальная биопсия с гистологическим исследованием препарата, окраска по Цилю-Нильсену, а также ПЦР смывов из ТБД на МБТ. У 70 % активность ангиотензинпревращающего фермента была выше, чем верхняя граница референтного интервала 70 ед./мл.

Были исследованы также сыворотки крови здоровых сотрудников противотуберкулезных учреждений (n=42), имеющих профессиональный контакт с больными ТБ не менее 1 года, не имеющие клинических и радиографических признаков активного ТБ (контактные лица, КЛ) в возрасте от 25 до 73 лет (18 % мужчин, 82 % женщин), средний возраст составил 48 лет (37,5 для мужчин и 57 для женщин). Группу сравнения составили 366 здоровых доноров (ЗЛ). Все лица, включенные в исследование (n=797), не были инфицированы ВИЧ.

Методы

Оптимизация первичной структуры химерного гена «esat6-cfp10». Нуклеотидную последовательность искусственного химерного гена, кодирующего полипептид, включающий полноразмерные аминокислотные последовательности белков ESAT6 и CFP10 Mtb, проектировали с использованием компьютерной программы GeneDesigner 2.0 фирмы DNA 2.0 (США), обеспечивающей оптимизацию кодонов в гене для эффективной его экспрессии в клетках E.coli. Кроме того, с применением разработанной нами программы проводили поиск пар кодонов, которые по литературным данным [10] затрудняют или даже останавливают трансляцию мРНК в E.coli, и заменяли их на синонимические кодоны.

Сборка и клонирование химерных генов «cbd-cfp10» и «cbd-esat6». Гены белков ESAT6 и CFP10 в составе вектора pJExpress401/esat6-cfp10 амплифицировали методом ПЦР с использованием соответствующих пар праймеров. Прямой и обратный праймеры, предназначенные для амплификации генов esat6 и cfp10, содержали на 5'-концах дополнительные последовательности, включающие сайты рестрикции AgeI и EcoRI (для гена esat6) и EcoRI и XhoI (для гена cfp10), соответственно. Полученные ампликоны после гидролиза эндонуклеазами рестрикции встраивали по этим сайтам в полилинкер плазмиды pETm/cbd, гидролизованной соответствующими рестриктазами, с использованием ДНК-лигазы фага Т4. Продукты гидролиза ДНК эндонуклеазами рестрикции и ампликоны генов анализировали с помощью электрофореза в 5 - 12 % ПААГ или в 0,8 – 2 % агарозном геле [3]. Последующие процедуры трансформации электрокомпетентных клеток E.coli BL21 (DE3) лигазными смесями, отбора рекомбинантных клонов на селективной среде и их анализа на наличие целевых ДНК-вставок проводили, как было описано нами ранее, для получения штамма E.coli - продуцента химерного белка «CBD-P38» [2].

Анализ экспрессии генов рекомбинантных химерных белков. Об экспрессии клонированных генов судили по данным электрофореза белков из лизатов клеток рекомбинантных клонов E.coli, проводившегося в пластинах полиакриламидного геля в денатурирующих условиях по методу Лэммли. Определение внутриклеточной локализации рекомбинантных химерных белков осуществляли согласно методике [15].

Выделение и очистка рекомбинантных белков. Клетки отобранных рекомбинантных клонов E.coli, продуцирующих химерные белки, выращивали в колбах вместимостью 2 л, содержащих 400 мл среды LB (0,5 % дрожжевого экстракта, 1 % триптона и 0,5 % NaCl) в присутствие 30 мкг/мл канамицина на орбитальном шейкере при 37 °С 120 об./мин. до оптической плотности OD600=1,0. Затем в культуру вносили ИПТГ до конечной концентрации 0,5 - 1 mM и продолжали выращивание клеток в течение ночи при 30 °С. Клетки осаждали центрифугированием при 5000 хg, 10 мин. Осадок клеток суспендировали в буфере, содержащем 50 mM Na-фосфат pH 8.0, 300 mM NaCl, из расчёта 3 - 5 мл буфера на 1 г веса клеток. В суспензию вносили лизоцим до конечной концентрации 1 - 2 мг/мл, инкубировали во льду 30 мин. и затем озвучивали суспензию в ледяной ванне 6 - 8 раз по 20 - 30 сек. на максимальной мощности (200 - 300 Ватт) УЗ-дезинтегратора. “Озвученную” суспензию освобождали от клеточного дебриса центрифугированием при 5000 хg 10 мин., а супернатант центрифугировали при + 4 °С 30 мин. при 40 000 хg. В надосадочной жидкости должны содержаться рекомбинантные антигены в растворимом состоянии, а в осадке телец включения - рекомбинантные белки в нерастворимой форме. В зависимости от локализации рекомбинантного белка в клетках E.coli (в растворимом состоянии в цитоплазме или в нерастворимом виде в тельцах включения) проводили аффинную хроматографию на колонке с Ni2+-NTA-сефарозе 6B-CL соответственно в нативных либо в денатурирующих условиях [2].

Получение лизата клеток E.coli для истощения исследуемых сывороток от антител к антигенам E.coli. Из выращенных клеток штаммов E.coli BL-21 (DE3) или Rosetta 2 (DE3), не содержащих рекомбинантных плазмид, получали “озвученные” суспензии как описано выше. После центрифугирования суспензий при +4 оС 30 мин. при 40 000 хg отбирали супернатант, расфасовывали его аликвотами по 1 - 2 мл и хранили при (минус 20 – минус 70) оС. Полученные супернатанты использовали в иммуноферментном анализе для истощения исследуемых сывороток от антител к антигенам E.coli.

Определение концентрации белка. Концентрацию рекомбинантного белка определяли по Лоури либо флуоресцентным методом при помощи прибора и набора Qubit® (Invitrogen, USA) согласно инструкции фирмы.

Твёрдофазный иммуноферментный анализ. Непрямой вариант ИФА для обнаружения IgG антител к полученным антигенам (ПТА) проводили по методике с использованием реагентов из набора «ИФА-анти-ТУБ», производства ФБУН НИИ имени Пастера (г. Санкт-Петербург). С целью определения оптимальной концентрации исследуемые антигены наносили в лунки планшета (Nunc Polysorp, Дания) в концентрациях от 10 до 0,05 мкг/лунку и проводили ИФА. Результаты определения показали, что 1 мкг антигенов на лунку является оптимальной дозой, при которой разница между оптической плотностью положительного и отрицательного пула является максимальной.

Статистическая обработка данных. Для статистической обработки полученных данных использовали пакеты программ MS Excel, SPSS (версия 13.0), Prizm 5.0 (GraphPad Software Inc.). Полученные данные представлены в виде медианы с указанием первого и третьего квартиля Me [Q1; Q3]. Для сравнения парных количественных значений использовали непараметрический критерий Манна-Уитни. Гипотезы рассматривались как статистически достоверные при p<0,05. Для оценки диагностической ценности ИФА с использованием указанных антигенов и выбора порогового значения применяли анализ характеристической кривой (receiver-operating-characteristic curve-ROC) с вычислением площади под характеристической кривой операционной характеристики (ППК). Для корреляционного анализа рядов данных использован метод ранговой корреляции по Спирмену.

Выбрать другой раздел данной публикации
Все публикации

Регистрационные удостоверения
Награды сотрудников отдела
  • Лучший доклад молодых ученых «Новые концепции механизмов воспаления, аутоиммунного ответа и развития опухоли» V Международной научно-практической конференции. Государственное бюджетное образовательное учреждение дополнительного профессионального образован
  • Диплом победителя конкурса «Лучшая работа молодого ученого» Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора «Актуальные проблемы эпидемиологии и профилактической медицины», г. Ставрополь, 22 – 24 октября 2014 г
  • Диплом «Победитель конкурса грантов Санкт-Петербурга для студентов, аспирантов, молодых ученых, молодых кандидатов наук 2014 г.»
  • Победитель Конкурса грантов Санкт-Петербурга для студентов, аспирантов, молодых ученых, молодых кандидатов наук 2010 г. Махлай Наталья Сергеевна
  • Победитель XIV Конкурса бизнес-идей, научно-технических разработок и научно-исследовательских проектов Молодые, дерзкие, перспективные. Ольга Валентиновна Заручейнова
  • Финалист XIV Конкурса бизнес-идей, научно-технических разработок и научно-исследовательских проектов Молодые, дерзкие, перспективные. Наталья Сергеевна Махлай
  • Победитель программы Участник молодежного научно-инновационного конкурса (УМНИК). Васильева Елена Викторовна. НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера
ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера
Отдел новых технологий
Факс
(812) 313-69-89
(812) 233-17-03